野猪是“受国家保护的有益的或者有重要经济、科学研究价值的陆生野生动物之一”。东北野猪属亚洲野猪东北亚种,主要分布在大兴安岭、小兴安岭、张广才岭、老爷岭、完达山、长白山,辽宁的东部横仁、宽甸等地,该区域冬季漫长、寒冷,最低气温可达-40.4℃。相对于家猪而言,东北野猪具有抗逆性高、抗病性强、食性广泛、对于自然界恶劣气候尤其是寒冷环境具有极强的耐受能力。目前国内外关于低温环境对野生动物影响的研究鲜有报道,更多是集中在对模式生物以及畜禽上的研究。研究内容大都集中于血液生化指标、激素和外周血液淋巴细胞热休克蛋白70(heat shock protein70, HSP70)的表达变化等方面,而在细胞水平上进行相关分子机制的研究报道并不多。细胞分子水平的变化是机体各种生理反应的基础,对细胞冷应激相关基因的研究有助于深入理解冷应激对机体影响的生物学机制。野猪是家猪的祖先,遗传基础与家猪相似,但未受到人工选择,其现有性状表型均是受自然选择的结果,因此,以野猪为实验材料,在细胞水平上研究低温环境对其机体影响的分子机制将更接近真实、客观的作用机理。本项目的研究结果将为今后更好的保护与利用野猪资源提供理论帮助。本研究首先构建东北野猪成纤维细胞培养体系,对细胞进行冷应激处理,对重要的冷应激蛋白冷诱导RNA结合蛋白进行克隆和分析,在此基础上,应用流式细胞术、RT-PCR和real-time PCR等实验技术,进一步研究冷应激对细胞周期、细胞凋亡及冷应激相关基因表达的影响及作用机理。从细胞分子水平研究东北野猪的抗寒冷机制,为研究冷应激分子机制建立科学的细胞模型提供理论参考,为体外培养细胞作为试验材料用于揭示机体冷应激分子机制提供了有力佐证,为利用东北野猪在改良家猪抗寒冷应激分子育种提供理论支持。主要研究结果如下：1东北野猪成纤维细胞培养体系的建立及生物学特性研究(1)组织块在贴壁时间为4h,胰酶消化3min,传代细胞贴壁时间为6h条件下,经2次传代便可得到纯化的成纤维细胞,成功建立简单易行的东北野猪成纤维细胞培养体系。(2)建立的东北野猪成纤维细胞系活率高、细胞生长迅速、细胞形态良好、无微生物污染。2冷诱导RNA结合蛋白基因克隆与序列分析从32℃处理的东北野猪成纤维细胞中提取总RNA,通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增CIRP的cDNA,构建重组克隆质粒PMD18-T,经PCR、酶切鉴定成功连接后,送测序公司测序。序列分析结果表明：东北野猪CIRP的cDNA被正确克隆,与其他生物CIRP具有较高的同源性。3冷应激对野猪成纤维细胞周期和凋亡的影响(1)持续低温培养抑制东北野猪成纤维细胞的增殖,使细胞产生GO/Gl期阻滞,诱导成纤维细胞凋亡,并随低温强度的增加而作用加强。但随培养时间的延长细胞对低温会产生耐受。(2)低温使复温培养的成纤维细胞产生G2/M期阻滞,同样诱导成纤维细胞凋亡,低温对复温培养细胞凋亡的诱导是一个延迟和渐进的过程,并随低温强度的增加而作用增强。4冷应激对野猪成纤维细胞HSP70、HSP90和CIRP的表达的影响(1)低温培养抑制HSP70mRNA和HSP90mRNA表达,诱导CIRP mRNA的表达,协助细胞获得冷耐受。(2)温和低温(32℃-25℃)诱导复温培养过程中的HSP70和HSP90mRNA表达有所增加,与对照组比差异不显著,但短时诱导CIRP mRNA的表达显著增加,保护细胞降低应激损伤。(3)强度低温(15℃-4℃)强烈诱导复温培养细胞的HSP70mRNA和HSP90mRNA表达,这种表达量的增加与低温强度密切相关,随着处理温度的降低,复温培养HSP70mRNA和HSP90mRNA表达水平升高,且HSP70mRNA的升高程度较HSP90mRNA明显。