乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染是一个世界性的问题。尽管有效的乙肝疫苗已在临床上广泛运用。慢性HBV感染能够导致肝硬化和肝细胞肝癌等危害严重的终末期肝病。虽然近年来有多种抗HBV药物不断涌现,但α干扰素(IFN-α)是目前治疗慢性HBV感染的首选药物之一,其具有疗程固定、停药后复发率低、部分患者可出现HBs Ag阴转而获得“彻底治愈”等优点。长效聚乙二醇干扰素还具有用药间隔时间长、副作用相对较少等优点。但目前仍面临着价格昂贵和相当一部分患者的持续病毒学应答率低等问题。IFN-α应答率低的具体分子机制仍不十分明确,有待进一步研究。在前期的工作当中我们发现慢乙肝患者IFN-α治疗前应答组和无应答组肝细胞中存在大量差异表达的基因。其中干扰素刺激基因USP18和ISG15位于同一信号通路,USP18在治疗前在无应答组中高表达,提示其可能与IFN-α抗HBV的活性相关,HBV可能调控宿主细胞中USP18的表达,进而改变IFN-α的抗病毒活性。目的:1.HBV感染肝癌细胞对USP18表达的影响。2.构建sh RNA-USP18慢病毒载体,研究其对Hepg2.2.15细胞内HBV复制能力的影响。3.研究sh RNA-USP18慢病毒载体在不同浓度IFN-α作用下对HBV复制能力的影响。4.研究sh RNA-USP18慢病毒载体是否是通过调控JAK/STAT信号通路调节IFN-α的抗HBV作用。5.利用生物信息学初步分析Hepg2.2.15-sh RNA-USP18细胞中的差异表达基因及相关信号通路。方法:1.利用实时荧光定量PCR分析不同肝癌细胞系中USP18 m RNA的表达水平。转染HBV表达质粒,利用实时荧光定量PCR、Western blot及双荧光素酶实验检测HBV感染对USP18 m RNA、蛋白及启动子活性的影响。2.构建sh RNA-USP18慢病毒载体,利用实时荧光定量PCR筛选出干扰效率最佳的慢病毒载体,并筛选出稳定细胞株。利用实时荧光定量PCR、Western blot验证Hepg2.2.15-sh RNA-USP18细胞中对USP18的干扰效率。3.利用定量PCR检测干扰USP18表达对Hepg2.2.15细胞中HBV DNA、pg RNA和total RNA复制的影响。利用ELISA检测干扰USP18对Hepg2.2.15细胞中HBs Ag和HBe Ag分泌的影响。利用荧光定量PCR检测过表达USP18对Hepg2.2.15细胞中HBV DNA、pg RNA和total RNA复制的影响。利用ELISA检测过表达USP18对Hepg2.2.15细胞中HBs Ag和HBe Ag分泌的影响。4.利用荧光定量PCR检测干扰USP18表达后IFN-α对Hepg2.2.15细胞中HBV复制的影响。利用ELISA检测干扰USP18表达后IFN-α对Hepg2.2.15细胞中HBs Ag和HBe Ag分泌的影响。利用Western blot检测干扰USP18表达后IFN-α对Hepg2.2.15细胞中HBc Ag生成的影响。5.利用荧光定量PCR检测干扰USP18表达后IFN-α对Hepg2.2.15细胞中JAK/STAT下游的干扰素刺激基因ISG15、Mx A和IFIT1 m RNA的影响。利用Western blot检测干扰USP18表达后IFN-α对Hepg2.2.15细胞中JAK/STAT下游的干扰素刺激基因ISG15、Mx A和IFIT1蛋白的影响。利用Western blot检测干扰USP18表达后IFN-α对Hepg2.2.15细胞中JAK/STAT信号通路中磷酸化STAT1及STAT1总蛋白表达的影响。利用Western blot检测干扰USP18表达后IFN-α处理不同时间点及不同加药方式对Hepg2.2.15细胞中JAK/STAT信号通路中磷酸化STAT1及STAT1总蛋白表达的影响。6.利用基因芯片检测干扰USP18表达后Hepg2.2.15细胞中差异表达的基因,并利用公共数据库及相关软件对差异表达的基因进行生物信息学分析。结果:1.Hepg2.2.15细胞中USP18的表达水平较其他肝癌细胞中的表达高,HBV明显促进宿主细胞中USP18的表达,选择Hep G2和Hepg2.2.15细胞用于后续实验。HBV感染能够促进Hep G2细胞中USP18 m RNA和蛋白的表达,并能增强其启动子活性。2.针对USP18筛选出干扰效率最佳的慢病毒载体并构建稳定细胞株Hepg2.2.15-sh RNA-USP18。Hepg2.2.15-sh RNA-USP18细胞中USP18m RNA和蛋白的表达受到明显抑制。3.干扰USP18表达后Hepg2.2.15细胞中HBV DNA、pg RNA和total RNA的复制受到明显抑制。Hepg2.2.15细胞中HBs Ag和HBe Ag的分泌受到明显抑制。过表达USP18后Hepg2.2.15细胞中HBV DNA、pg RNA和total RNA的复制明显增强。Hepg2.2.15细胞中HBs Ag和HBe Ag的分泌明显增强。4.干扰USP18表达后IFN-α对Hepg2.2.15细胞中HBV DNA、pg RNA和total RNA复制的抑制作用明显增强。干扰USP18表达后IFN-α对Hepg2.2.15细胞中HBs Ag和HBe Ag分泌的抑制作用明显增强。干扰USP18表达后IFN-α对Hepg2.2.15细胞中HBc Ag生成的抑制作用明显增强,且在IFN-α不同浓度组中均有明显的抑制作用。5.干扰USP18表达后IFN-α对Hepg2.2.15细胞中JAK/STAT下游的干扰素刺激基因ISG15、Mx A和IFIT1 m RNA和蛋白的诱导作用明显增强。干扰USP18表达后IFN-α对Hepg2.2.15细胞中JAK/STAT信号通路中磷酸化STAT1表达的诱导作用明显增强。干扰USP18表达后IFN-α处理不同时间点,Hepg2.2.15细胞中JAK/STAT信号通路中磷酸化STAT1表达明显增强。不同加药方式下干扰USP18表达后Hepg2.2.15细胞中JAK/STAT信号通路中磷酸化STAT1表达明显增强。6.初步筛选出干扰USP18后Hepg2.2.15细胞中差异表达的基因及相关的生物学功能和信号通路。结论:1.肝癌细胞Hep G2中HBV感染可促进USP18的表达并增强USP18启动子的活性。2.干扰USP18表达后Hepg2.2.15细胞中HBV的复制和分泌受到明显抑制。3.干扰USP18表达后IFN-α对Hepg2.2.15细胞中HBV的抑制作用增强。4.USP18能够通过调节JAK/STAT信号通路的活性来调节IFN-α的抗病毒活性。