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植物细胞色素P450(CYP450)超基因家族编码的单加氧酶参与多种催化反应,在植物防御非生物胁迫中具有重要作用?本文分析了豆科模式植物蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中MtCYP450表达特性及功能,以期为改善豆科牧草耐盐性提供参考。主要研究结果如下:1、克隆蒺藜苜蓿MtCYP450并进行生物信息学分析。该基因编码508个氨基酸,蛋白分子量为58.31 kDa,等电点为6.85?二级结构主要由α-螺旋(约44%)组成,β-折叠、转角结构和无规则卷曲分别约占20%?序列同源性分析显示,蒺藜苜蓿MtCYP450与豆科植物狭叶羽扇豆(Lupinus angustifolius)和大豆(Glycine max)中的CYP94亚家族氨基酸序列同源性较高,依次为75.7%和73.9%。因此,MtCYP450属于细胞色素P450的CYP94亚家族?2、分析MtCYP450在蒺藜苜蓿不同组织中的表达量及对胁迫处理的反应。荧光定量PCR结果显示MtCYP450在苜蓿根、茎、叶、花和果荚中均有表达,其中叶片中表达量最高,根中最低,仅为叶片的1.2%。在胁迫处理(200 mM NaCl、5%PEG、100μM ABA和100μM MeJA)后,叶片中MtCYP450基因表达量显著上升?因此,蒺藜苜蓿MtCYP450受以上胁迫诱导表达。3、获得耐盐性增强的超表达MtCYP450拟南芥。构建超表达载体pBI121-MtCYP450,转化拟南芥并获得8个阳性转基因株系。qRT-PCR证明转基因株系中外源MtCYP450在拟南芥中成功转录?T2代超表达MtCYP450拟南芥在NaCl和PEG处理后MtCYP450表达量均上升。对转MtCYP450拟南芥的生长情况分析显示转基因拟南芥在NaCl(125 mM)处理后根长是野生型的1.63倍,表明MtCYP450增强了拟南芥根系的耐盐性。4、分别获得了超表达和敲除MtCYP450基因的转基因苜蓿。将表达载体pBI121-MtCYP450转化蒺藜苜蓿,通过基因组水平和转录水平鉴定获得32个超表达MtCYP450蒺藜苜蓿株系。同时,利用CRISPR/Cas9技术,构建基因敲除表达载体pRGEB31-MtCYP450并转化蒺藜苜蓿。测序结果表明已获得12个MtCYP450基因敲除的突变植株株系。该材料将用于蒺藜苜蓿MtCYP450基因耐盐性研究。