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目的:研究环磷酸腺苷cAMP调控体外培养的人巩膜成纤维细胞(humanscleralfibroblasts,HSF)胶原合成及其信号通路。
方法:体外培养HSF,取5~8代的细胞,MTS法检测药物对HSF细胞增殖的影响;cAMPFluorescentAssayKit检测腺苷酸环化酶AC激活剂Forskolin/cAMP类似物db-cAMP刺激HSF后细胞内cAMP的含量;SircolCollagenAssayKit检测Forskolin/db-cAMP刺激HSF后上清液中总可溶性胶原的变化;Real-timePCR检测Forskolin/db-cAMP或Forskolin与AC拮抗剂SQ22536/ERK抑制剂PD98059联合刺激HSF后细胞内胶原Ⅰ,Ⅲ,VmRNA表达情况;3D方法培养HSF,观察Forskolin/db-cAMP影响胶原凝胶的面积大小;Westernblot方法检测Forskolin刺激HSF后细胞内信号传导通路蛋白CREB、ERK1/2磷酸化程度,探索cAMP调节HSF胶原合成的信号通路。
结果:
1.实验中所用药物浓度刺激HSF24h后对HSF细胞增殖无明显影响;
2.10μMForskolin和100μMdb-cAMP可以显著增加细胞内cAMP水平;
3.100nM-10μMForskolin/db-cAMP均可以抑制HSF上清中总可溶性胶原量表达;
4.100nM-10μMForskolin/db-cAMP可以抑制HSF胶原Ⅰ,Ⅲ,VmRNA的表达,而100μMSQ22536与10μMForskolin联合应用可以部分抵消由Forskolin所抑制的HSF胶原Ⅰ,Ⅲ,VmRNA表达的能力;
5.与对照组相比,1μMdb-cAMP/10μMForskolin可以抑制胶原凝胶收缩;
6.10μMForskolin刺激HSF10min后,ERK1/2、CREB的磷酸化水平升高,60min后降低;
7.10μMForskolin与10μMPD98059联合刺激HSF后,PD98059可以部分抵消由Forskolin抑制的HSF胶原Ⅰ,Ⅲ,VmRNA的表达。
结论:
1.通过升高细胞内cAMP水平,可以抑制HSF的胶原合成;
2.cAMP可以通过激活ERK1/2蛋白来调节HSF胶原合成;
3.cAMP有可能成为近视药物治疗研发的新的分子靶点,为近视的药物治疗开发奠定基础。