萜类化合物是自然界中广泛存在的一类天然烃类化合物，是中药和天然植物药的主要有效成分，也是化妆品和食品工业等不可缺少的原料。其种类繁多，根据类异戊二烯基的数目可以将萜类分为单萜、倍半萜、二萜、三萜和四萜等。从天然原料直接提取或者通过化学法合成萜类化合物存在生产效率低，成本高及环境污染严重等诸多问题，而基于微生物代谢工程改造的方法可以为萜类化合物的生产提供新的策略。解脂耶氏酵母被认为是安全可靠的菌株，可用于食品和药品等的生产。此外，解脂耶氏酵母作为细胞工厂还具有诸多优势:碳源谱广泛，能够利用大量的亲水性和疏水性化合物作为底物;其全基因组已被测通，对其遗传特性改造的分子工具比较成熟;作为非常规酵母，可以抵抗噬菌体污染等。最重要的，解脂耶氏酵母作为产油脂酵母在生产疏水性萜类化合物时具有天然优势。基于上述解脂耶氏酵母菌的优点，本研究将选择其作为宿主菌，通过代谢工程、合成生物学及发酵优化等手段对其进行改造，使其成为能高产萜类化合物的底盘细胞（本课题中选择了该菌株自身不能合成单萜类化合物，如柠檬烯和芳樟醇，以及自身能合成的三萜类化合物鲨烯），从而为萜类化合物的工业化生产提供新的路径。　　在以解脂耶氏酵母为底盘细胞异源高效合成单萜类化合物的研究中，首先选取柠檬烯作为目标产物。在探究柠檬烯在解脂耶氏酵母中的异源生物合成途径时，发现在宿主中异源表达经密码子优化的柠檬烯合成酶基因LS（藿香来源）后检测不到柠檬烯的合成。而当将LS基因和橙花基二磷酸合成酶基因NDPS1（番茄来源）在解脂耶氏酵母中共表达后，可成功实现柠檬烯在解脂耶氏酵母菌中的异源合成，尽管其产量仅为0.103mg/L。上述结果表明单环单萜类化合物柠檬烯在解脂耶氏酵母中生物合成的前体是橙花基二磷酸(NPP)而非香叶基焦磷酸(GPP)。其次，解脂耶氏酵母菌中存在甲羟戊酸途径（Mevalonate pathway，或称MVA途径），可为萜类化合物的合成提供重要前体。本课题因此选择对MVA途径各功能模块进行分子改造，以期促进柠檬烯在该菌株中的合成。所采取的策略是考察MVA途径中若干关键基因（HMG1、ERG8、ERG10、ERG12、ERG19、IDI1等）的不同拷贝数及不同组合表达对解脂耶氏酵母生物合成柠檬烯的影响。实验结果显示，MVA途径改造的最优表达组合为共同过表达HMG1和ERG12基因，所得工程菌Polf-LN-051的柠檬烯产量相对于初始菌株提高了74倍(7.73mg/L)。最后，对工程菌Polf-LN-051在发酵培养基YPD中丙酮酸和十二烷的添加量进行优化后，并进一步提升柠檬烯产量至23.56mg/L，是目前摇瓶水平上利用酵母异源合成柠檬烯的最高产量。　　为了探究解脂耶氏酵母异源合成柠檬烯的代谢改造思路是否同样适用于开环单萜类化合物的合成，本研究选取芳樟醇作为研究目标。将经过密码子优化的猕猴桃来源的芳樟醇合成酶基因LIS在解脂耶氏酵母Polf中表达，成功构建了可异源合成芳樟醇的解脂耶氏酵母菌株，芳樟醇的初始产量为0.09mg/L，这也说明开环单萜化合物芳樟醇在解脂耶氏酵母中的生物合成可以直接利用GPP作为前体。接着基于合成柠檬烯时的MVA途径改造思路对芳樟醇生产的工程菌株也进行了尝试，发现当HMG1和IDI1基因共同过表达时芳樟醇产量可达1.44mg/L。该结果表明MVA途径的模块改造同样有利于促进开环单萜化合物在解脂耶氏酵母中积累，同时也暗示了对不同前体由来的单萜化合物MVA途径的模块优化方式也不尽相同。FPP合成酶ERG20催化GPP的合成以及GPP到FPP的转化，为了增加GPP积累从而进一步提高芳樟醇产量，对解脂耶氏酵母ERG20基因进行定点突变后在出发菌中表达，结果显示芳樟醇产量显著提高，而柠檬烯合成却没有变化。结合上述最优过表达方式可提高解脂耶氏酵母工程菌的芳樟醇产量至5.34mg/L。在进一步优化部分发酵条件后获得6.96mg/L芳樟醇，该产量是出发菌的77倍，也是目前报道的利用酵母在摇瓶中异源合成芳樟醇的最高产量。　　此外，本研究探究了上述改造解脂耶氏酵母异源合成单萜化合物的方法在过量合成酵母内源萜类化合物鲨烯时的效果。不同于单萜化合物，三萜化合物的鲨烯是由ERG9合成酶直接催化FPP所合成，ERG9基因的表达水平直接影响到鲨烯的生产，因此在过表达MVA途径中基因时结合对ERG9基因的共同过表达，使得鲨烯产量相比野生型Polf提高了近30倍。其次，油脂积累的增加可能有助于鲨烯的生物合成，为此对油脂合成途径DGA1基因进行过表达或者对脂肪酸β氧化途径基因PEX10以及氮代谢调控基因URE2进行敲除以提高细胞内油脂含量，结果表明鲨烯产量与对照菌Polf相比提高了90倍。综合上述两种改造策略，即双敲PEX10/URE2基因，同时共过表达HMG1，ERG9及DGA1可使鲨烯的产量提高到240.47mg/L，为原始菌Polf的114倍。　　本研究以解脂耶氏酵母为底盘细胞，探索其高效合成单萜及三萜类化合物的策略，并获得了柠檬烯、芳樟醇和鲨烯等合成能力提高了的工程菌株，为微生物合成法取代由天然提取及化学合成组成的传统生产方法提供了相关研究基础。此外本研究的思路及策略，也为解脂耶氏酵母或其它酵母高效合成多种萜类化合物提供了一定的借鉴。