原生质体培养及体细胞杂交技术为柑橘遗传育种工作开辟了一条新思路,它已成为柑橘砧木及接穗品种改良的重要手段。目前,柑橘原生质体主要由愈伤组织和叶片分离而来,但只有来于前者的原生质体能持续分裂并再生,而叶肉原生质体目前还不能单独用于柑橘遗传改良。迄今,这两种类型原生质体再生能力差异的机制尚不清楚。已有研究表明,活性氧(ROS)引起的氧化胁迫可能是造成不可再生型原生质体再生难的原因,然而另一方面ROS作为信号分子,对原生质体再生具有重要的调控作用,抑制其产生会导致原生质体不可分裂再生。基于此,本论文以椪柑愈伤组织和叶片为起始材料,采用荧光标记法分析了ROS在椪柑原生质体分离与培养中的动态变化,同时通过NADPH氧化酶特异性抑制剂DPI和过氧化物酶抑制剂NaN3处理探究了其ROS的来源；分析了NADPH氧化酶基因家族成员在碰柑原生质体分离培养过程中的表达情况,克隆了一个特异表达的NADPH氧化酶基因( Crrboh10)；构建了Crrboh10的过表达载体,通过农杆菌介导转化法获得了转基因愈伤组织,并测定了碰柑转基因愈伤组织和非转基因愈伤组织的可溶性蛋白含量和H202含量。主要研究结果如下：1.选取椪柑愈伤组织与叶肉原生质体分离与培养过程中5个时间点：即酶解2小时、4小时、6小时,培养4天、8天的原生质体,进行ROS荧光探针染色并用共聚焦显微镜观察检测。结果表明,在愈伤组织原生质体培养阶段,细胞膜上出现明显的ROS信号,而叶肉原生质体中ROS信号无明显差异；分离阶段愈伤组织原生质体其ROS水平显著低于叶肉原生质体,但在培养阶段显著高于叶肉原生质体。2.选取椪柑愈伤组织原生质体体分离与培养过程中4个时间点：即酶解2小时、培养4天、8天、12天的原生质体,进行DPI和NaN3处理。结果表明,两种抑制剂处理均降低了原生质体分离与培养过程中的ROS水平,表明椪柑愈伤组织原生质体其活性氧产生源有NADPH氧化酶和过氧化物酶。3.利用半定量RT-PCR方法分析了13个柑橘NADPH氧化酶基因在原生质体分离与培养过程中的表达情况。结果表明,中共检测到9个基因(Crrbohl、Crrboh2、Crrboh5-6、Crrboh8-9及Crrboh10-12)的表达,且变化趋势有明显差异；不表达的基因是Crrboh3、Crrboh4、Crrboh7、 Crrbohl3.4.克隆了碰柑Crrboh10基因,并对其进行表达分析。该基因全长2812 bp,开放阅读框2748 bp,编码915个氨基酸；该基因编码的蛋白分子量为103.51kD,理论等电点为9.11。使用实时定量PCR分析Crrboh10基因在椪柑组织中表达情况,发现其在根、茎、叶、愈伤组织中均有表达,表达量由高到低依次为愈伤组织、叶、根、茎。5.将椪柑Crrboh10基因导入植物双元表达载体pMD1301上,构建了pMD1301-Rboh10超表达载体以及将其导入农杆菌EHA105。以椪柑愈伤组织为外植体,通过农杆菌介导法进行遗传转化,采用GUS组织化学染色和实时定量PCR技术对转化材料进行鉴定,成功获得了转基因的愈伤组织。6.转基因愈伤组织的可溶性蛋白含量高达0.543g/L,非转基因愈伤组织为0.457g/L；转基因愈伤组织的H2O2含量为11.24mmol/gprot,而非转基因愈伤组织的H2O2含量仅为4.26mmol/gprot,且两者存在显著性差异。