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乳腺癌转移是造成病患死亡的主要原因之一。有关高转移倾向的乳腺癌细胞保持其高转移高增殖能力的机制尚不清楚,有报道称,脂肪酸合成酶(FAS)在肿瘤细胞的增殖中起到了很重要的作用,但其信号转导机制尚不明了。本实验室前期研究发现,花生四烯酸的代谢产物可激活Gi/o/PLC/PKC/p-ERK1/2,并形成正反馈环路,进一步激活p-ERK1/2的下游信号分子,从而促进乳腺癌细胞的高增殖和迁移。本文对脂肪酸合成酶促进乳腺癌细胞增殖的信号通路及其与已发现正反馈环路的关系进行了研究。主要研究内容及结果如下:
⑴应用报告基因的方法对MCF-7与LM-MCF-7细胞之间脂肪酸合成酶的转录活性差异进行了检测。结果发现,高转移能力乳腺癌细胞系LM-MCF-7中的FAS的转录活性明显高于低转移乳腺癌细胞系MCF-7。
⑵根据实验室前期发现的p-ERK1/2/arachidonic acid代谢产物/Gi/PLC/PKC/p-ERK1/2正反馈环路维持了乳腺癌细胞的增殖。我们应用报告基因实验,分别检测了COX、LOX、P450、G蛋白和酪氨酸的抑制剂Indomethacin(Indo)、NDGA、SKF525A、PTX和AG112对LM-MCF-7细胞中FAS转录水平的影响。结果显示,在LM-MCF-7细胞中,脂肪酸合成酶的转录活性可被脂氧化酶LOX抑制剂NDGA以时间依赖和浓度依赖的方式抑制。丝裂原活化蛋白激酶ERK抑制剂PD98059也同样有抑制效果。但是,环氧化酶COX抑制剂INDO,细胞色素P450抑制剂SKF,G蛋白抑制剂PTX和酪氨酸激酶抑制剂AG112无抑制效果。上述结果表明,脂肪酸合成酶转录活性的增加与ERK及LOX的信号有关。
⑶在发现高转移能力乳腺癌LM-MCF-7细胞中的脂肪酸合成酶转录活性上调与p-ERK1/2和LOX有关的基础上,我们进一步检测了高低转移细胞系中p-ERK1/2和LOX的表达水平。通过蛋白免疫印迹实验,我们发现高转移能力乳腺癌LM-MCF-7细胞中的ERK磷酸化水平明显高于MCF-7细胞;RT-PCR、蛋白免疫印迹和免疫组化结果都显示,LM—MCF-7细胞中的5-LOX和12R-LOX表达水平也明显高于MCF-7细胞。
⑷为了进一步确定p-ERK1/2、LOX和FAS的相互关系,在LM-MCF-7细胞中加入FAS抑制剂Cerulenin之后,发现p-ERK1/2和5-LOX表达水平被明显下调,而12R-LOX没有受到影响;p-ERK1/2的抑制剂PD98059可明显下调5-LOX的表高达水平。结果表明,LM-MCF-7细胞中FAS通过激活ERK的活性上调了5-LOX的表达。
⑸由此推测,AA经5-LOX作用的代谢产物可以提高FAS的转录活性。为了验证这一假设,在LM-MCF-7细胞中,加入5-LOX特异性抑制剂。MK-886,报告基因和RT-PCR结果显示,FAS转录活性被抑制,ELISA实验结果显示,5-LOX作用于AA的代谢产物LTB4在LM-MCF-7细胞培养液中的含量下降。在MCF-7细胞中,外源性的LTB4可以以时间依赖和浓度依赖的方式增强FAS的转录活性、提高ERK的磷酸化水平和5-LOX的表达水平。我们又通过报告基因实验检测发现,MCF-7细胞中加入LM-MCF-7细胞条件培养液,可以提高其FAS的转录活性。
⑹应用BrdU掺入实验检测了上述信号通路的功能。结果显示,ERK抑制剂PD98059、5-LOX抑制剂MK-886和FAS抑制剂Cerulenin分别均可抑制LM-MCF-7细胞的增殖,而LTB4能够促进MCF-7细胞的增殖。
⑺发现维持ERK高磷酸化活性进而保持高转移乳腺癌LM-MCF-7细胞高增殖特性的另一个环路。在此通路中,p-ERK1/2促进了AA的释放,并通过上调5-LOX增加了AA代谢产物LTB4的含量,最终导致FAS转录活性的上调。同时,FAS通过正反馈又激活了ERK。