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第一部分:不同程度炎性血管内皮细胞损伤时线粒体功能及PGC-1α、NFAT的变化目的:观察肿瘤坏死因子(TNF-α)诱导的离体血管内皮细胞损伤后线粒体功能、过氧化物酶体增殖物活化受体γ共激活因子-1α(PGC-1α)、活化T细胞核因子1(NFAT1)、活化T细胞核因子2(NFAT2)的变化。方法:1、不同浓度的TNF-α(10、20、40、80ng/ml)刺激人脐静脉内皮细胞(HUVECs)12、24、36小时制备不同程度的血管内皮细胞损伤模型,CCK-8法检测细胞活性、Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡、倒置光学显微镜下观察细胞形态,以此确定模型是否建立成功。2、采用Jc-1免疫荧光染色结合荧光显微镜检测线粒体膜电位,Mito SOX?Red染色结合荧光显微镜检测线粒体活性氧(mt ROS)。3、采用RT-q PCR、Western blot方法分别检测PGC-1α、活化T细胞核因子1(NFAT1)、活化T细胞核因子2(NFAT2)m RNA及蛋白水平。结果:1、不同程度的血管内皮细胞损伤模型成功建立。CCK-8法结果显示,与对照组细胞相比,TNF-α作为炎性刺激,随着其刺激浓度及作用时间的增加,HUVECs活性逐渐下降,在浓度为40ng/ml,刺激时间为24小时细胞活性下降约49%,接近TNF-α诱导HUVECs损伤的IC50,差异有统计学意义(P<0.05)。20、40、80ng/ml TNF-α刺激HUVECs 24h后,细胞凋亡率逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05)。光学显微镜下显示:对照组细胞生长正常,形态为多边形、梭形,并呈铺路石样。20ng/ml TNF-α处理组细胞形态变化不明显,当TNF-α的浓度为40ng/ml时,细胞形态拉长,细胞间隙增大,当TNF-α的浓度为80ng/ml,细胞形态学改变更为明显,甚至部分细胞可见到伪足伸展。2、线粒体功能变化:Jc-1免疫荧光染色结合荧光显微镜检测线粒体膜电位,Mito SOX?Red染色结合荧光显微镜检测mt ROS结果显示:与对照组细胞比较(JC-1:2.74±0.06;mt ROS:1.86±0.12),随着TNF-α刺激浓度的增加,线粒体膜电位逐渐下降(1.77±0.08,0.51±0.09,0.23±0.12),mt ROS逐渐增加(2.97±0.14,3.36±0.14,4.28±0.19),差异均具有统计学意义(P<0.05)。3、RT-q PCR、Western blot检测不同浓度TNF-α(20、40、80ng/ml)刺激HUVECs 24小时后各组PGC-1αm RNA及蛋白水平的表达。结果显示:与对照组比较(m RNA:1.00±0.09;蛋白:2.16±0.05),各实验组PGC-1αm RNA及蛋白水平逐渐降低(m RNA:0.51±0.05,0.08±0.04,0.02±0.01;蛋白:1.56±0.05,0.78±0.08,0.50±0.12),差异均具有统计学意义(P<0.05)。4、RT-q PCR、Western blot检测不同浓度TNF-α(20、40、80ng/ml)刺激HUVECs 24小时后各组NFAT1、NFAT2 m RNA及蛋白水平的表达。结果显示:与对照组比较(NFAT1:m RNA 1.00±0.06,蛋白0.54±0.12;NFAT2:m RNA 1.00±0.08,蛋白0.09±0.02),各实验组NFAT1、NFAT2 m RNA及蛋白水平逐渐升高(NFAT1:m RNA0.91±0.07,1.97±0.16,2.93±0.01,蛋白0.50±0.04,0.95±0.46,1.18±0.09;NFAT2:m RNA 1.96±0.09,2.85±0.43,3.86±0.15,蛋白0.17±0.03,0.36±0.13,0.64±0.06),刺激浓度为40、80ng/ml时差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论:1、20、40、80ng/ml TNF-α可致不同程度HUVECs损伤。2、线粒体功能障碍、NFAT表达可能参与了TNF-α诱导HUVECs损伤。第二部分:PGC-1α对TNF-α诱导的血管内皮细胞损伤及NFAT表达的影响目的:明确PGC-1α对TNF-α诱导的血管内皮细胞损伤及NFAT表达的影响,并探讨其中的机制。方法:体外培养HUVECs,采用慢病毒转染法将PGC-1α过表达、干扰PGC-1αRNA慢病毒转染HUVECs。PGC-1α基因沉默实验组分为:si-Null(下调对照)组、si-PGC-1α(PGC-1α基因沉默)组;PGC-1α过表达实验分组为:Lv-Null(上调对照)组,Lv-PGC-1α(过表达PGC-1α)组,Lv-Null+TNF-α组,Lv-PGC-1α+TNF-α组。采用CCK-8法检测细胞活性,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡,倒置光学显微镜下观察细胞形态。采用Mito SOX?Red检测mt ROS,Fluo 3-AM检测细胞内钙离子(Ca2+)水平,RT-q PCR、Western blot法分别检测活化T细胞核因子1和2(NFAT1、NFAT2)m RNA和蛋白表达水平。结果:1、慢病毒MOI值为20时转染效率可达90%以上。2、(1)PGC-1α基因沉默组:与下调对照组比较,PGC-1α基因沉默组HUVECs活性下降(0.71±0.84vs1.00±0.04),细胞凋亡率增加(7.43%±0.83%vs4.63%±0.04%),差异均具有统计学意义(P<0.05)。细胞间隙较下调对照组减小,伪足增多。细胞内mt ROS水平升高(1.61±0.09vs0.81±0.14),Ca2+浓度升高(4.27±0.27vs2.73±0.31),NFAT1、NFAT2 m RNA和蛋白表达水平均升高(m RNA:NFAT1:2.43±0.02vs1.00±0.05;NFAT2:2.15±0.05vs1.00±0.06,P<0.05。蛋白:NFAT1:0.95±0.10vs0.68±0.02,NFAT2:0.91±0.02vs0.73±0.03,P<0.05)。(2)PGC-1α过表达组:予40 ng/ml TNF-α处理后,与上调对照组比较,PGC-1α过表达组细胞活性升高(0.80±0.13vs0.59±0.01),细胞凋亡率降低(12.1%±0.04%vs21.3%±0.07%),细胞形态变化稍恢复,PGC-1α过表达组细胞内mt ROS水平降低(3.29±0.47vs5.91±0.76),细胞内Ca2+浓度降低(5.24±0.24vs6.31±0.26),NFAT1、NFAT2 m RNA和蛋白表达水平均降低m RNA:NFAT1,0.70±0.02vs1.00±0.01;NFAT2:0.67±0.02vs1.00±0.001,P<0.05。蛋白:NFAT1:0.72±0.03vs0.95±0.02,NFAT2:0.75±0.02vs0.95±0.03,P<0.05)。结论:1、PGC-1α对TNF-α诱导的HUVECs损伤具有保护作用。2、PGC-1α可降低TNF-α诱导的HUVECs内mt ROS升高水平。3、PGC-1α可通过降低细胞内mt ROS水平,从而抑制Ca2+/NFAT通路实现对TNF-α诱导的HUVECs损伤的保护作用。