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D-型氨基酸氧化酶(D-amino acid oxidase,DAO)是一种以FAD为辅基的过氧化物酶体酶,催化D-丝氨酸(D-serine,D-Ser)等D-型氨基酸生成相应的α-酮酸、NH3和H2O2。最近研究发现,D-Ser是NMDA受体甘氨酸位点的内源性配体,DAO有可能通过对D-Ser的代谢清除而影响NMDA受体的功能；另一方面,DAO催化D-Ser的氧化代谢产生H2O2,导致组织活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平升高。NMDA受体、活性氧与疼痛的发生和痛觉调制密切相关,DAO因此可能参与疼痛的发生和痛觉调制,本课题就DAO在疼痛尤其是慢性疼痛中枢敏感化中的作用进行了探讨:
首先,为了确定DAO在疼痛中的确切作用,本实验利用DAO基因缺陷的ddY/DAO-小鼠和DAO特异性抑制剂苯甲酸钠,在福尔马林实验(第Ⅰ相急性疼痛和第Ⅱ相中枢敏感化疼痛)、扭体实验(内脏炎性疼痛模型)、热水甩尾实验(脊髓水平低级中枢参与的急性疼痛模型)和热板实验(脊髓以上高级中枢参与的急性疼痛模型)四种不同类型的疼痛模型中全面考察了ddY/DAO-小鼠的痛敏感性和苯甲酸钠的镇痛作用。结果发现,ddY/DAO-小鼠在福尔马林实验、扭体实验、热水甩尾实验和热板实验中,痛敏感性明显低于野生型(ddY/DAO+)对照小鼠；尾静脉注射苯甲酸钠对福尔马林引起的第Ⅱ相痛反应、醋酸引起的扭体反应具有显著的镇痛作用,而对甩尾实验、热板实验的痛阈值和福尔马林所致第Ⅰ相痛反应无明显影响。
大鼠福尔马林致痛模型和神经源性疼痛模型是研究中枢敏感化常用的疼痛模型。为了确定DAO在慢性疼痛中枢敏感化中的作用,我们接下来利用大鼠福尔马林致痛模型和L5/L6脊神经结扎所致神经源性疼痛模型,观察了DAO特异性抑制剂苯甲酸钠对中枢敏感化疼痛的镇痛作用。结果显示,腹腔注射苯甲酸钠剂量依赖性地抑制中枢敏感化参与的福尔马林所致大鼠的第Ⅱ相痛反应(痛觉过敏),其ED50为436 mg/kg；同样,腹腔注射苯甲酸钠也能显著抑制中枢敏感化参与的神经源性疼痛大鼠的机械性痛超敏,却不影响福尔马林所致大鼠的第Ⅰ相痛反应和热水甩尾实验的甩尾潜伏期等无中枢敏感化参与的急性疼痛。另外,鞘内注射苯甲酸钠(30μg/rat,剂量仅为腹腔注射给药途径ED50的1/2000)也能明显抑制福尔马林引起的痛觉过敏(第Ⅱ相痛反应)和神经源性疼痛大鼠的机械性痛超敏。并且,腹腔注射苯甲酸钠能显著抑制腰膨大段脊髓组织中DAO的酶活性。结果表明,抑制脊髓组织中DAO的功能显著抑制中枢敏感化参与的慢性疼痛,却不影响急性疼痛的生理性痛觉传导通路。
最后,我们通过皮下注射福尔马林和L5/L6脊神经结扎复制中枢敏感化疼痛大鼠模型,利用半定量RT-PCR及实时荧光定量PCR技术检测脊髓组织中DAO mRNA水平,以D-丙氨酸为底物应用比色法检测DAO的酶活性,观察中枢敏感化疼痛大鼠腰膨大段脊髓组织中DAO mRNA水平和酶活性的改变,初步探讨DAO在慢性疼痛中枢敏感化的形成和维持中的分子机制。结果发现,大鼠在福尔马林注射后1小时表现出明显的痛觉过敏(第Ⅱ相痛反应),同时伴有脊髓组织中DAO mRNA水平的显著升高；神经源性疼痛大鼠在L5/L6脊神经结扎后1～28天表现出明显的机械性痛超敏,其痛阈显著低于术前对照组和同时段假手术组,神经源性疼痛大鼠术后1天和2天脊髓组织中DAO mRNA的水平亦显著高于术前对照组和同时段假手术组。对DAO酶活性的检测也发现,福尔马林注射后1小时,大鼠脊髓组织中DAO的酶活性与福尔马林注射前相比显著升高,之后恢复至接近正常；神经源性疼痛大鼠在L5/L6脊神经结扎后1小时,脊髓组织中DAO的酶活性与术前相比显著升高,2小时后酶活性则降低至略低于正常水平,之后酶活性逐渐升高,在术后48小时酶活性显著高于术前对照组和同时段假手术组。
综上所述,本课题的研究表明,中枢敏感化疼痛大鼠脊髓组织中DAOmRNA的水平和酶活性伴随中枢敏感化疼痛的行为学表现显著升高,在脊髓水平抑制DAO的功能对中枢敏感化疼痛具有明显的镇痛作用,提示在慢性疼痛的发生和持续过程中,脊髓组织中DAO催化D-Ser产生H2O2的功能增强,参与脊髓水平慢性疼痛的中枢敏感化,促进神经源性疼痛等慢性疼痛的发生。因此,DAO可能是一个治疗神经源性疼痛等慢性中枢敏感化疼痛的新靶点,即通过抑制DAO的功能,使神经源性疼痛等慢性疼痛得到缓解,且对生理性痛觉传导通路传导急性疼痛没有明显影响,这些结果为寻找新型镇痛药(DAO抑制剂)奠定了一定的理论基础。