【摘 要】
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鲍养殖是我国重要海水养殖之一,鲍养殖产量已从2003年不足1万吨到2019年18.03万吨,增长了将近18倍。遗传育种则是支撑鲍养殖快速增长的重要技术,在遗传育种中出现的杂交不亲和现象也逐渐引起了人们的关注。本文以皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai Ino,1952）、西氏鲍（Haliotis sieboldii Reeve,1846）为主要研究对象,采用细胞学、细胞遗传学、蛋
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鲍养殖是我国重要海水养殖之一,鲍养殖产量已从2003年不足1万吨到2019年18.03万吨,增长了将近18倍。遗传育种则是支撑鲍养殖快速增长的重要技术,在遗传育种中出现的杂交不亲和现象也逐渐引起了人们的关注。本文以皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai Ino,1952）、西氏鲍（Haliotis sieboldii Reeve,1846）为主要研究对象,采用细胞学、细胞遗传学、蛋白原核表达及蛋白分离纯化技术对其受精过程可能产生的不亲和现象进行初步解析。主要研究结果如下:1.通过对精子、卵子排放时间对皱纹盘鲍和西氏鲍杂交受精率影响的研究中发现,杂交组合中,若以皱纹盘鲍为母本,西氏鲍为父本,则精子应在排放后30 min内,卵子应在排放后20 min内进行授精否则受精率将快速下降至35%以下;若以西氏鲍为母本,皱纹盘鲍为父本,则精子应在排放后60 min内,卵子应在排放后20 min内进行授精,否则受精率将快速下降至30%以下。杂交受精率的统计结果结合扫描电镜证明皱纹盘鲍、西氏鲍异种受精过程能正常引起顶体反应,并释放顶体泡。2.运用分子克隆手段将皱纹盘鲍和西氏鲍细胞溶素进行序列重组,并进行原核表达,产物经过透析、超高速离心等蛋白分离纯化方法最终得到了纯净的细胞溶素蛋白溶液。将细胞溶素序列构建系统进化树得出皱纹盘鲍与西氏鲍碱基相似度为94.84%,与绿鲍碱基相似度为84.09%,所以得出皱纹盘鲍与西氏鲍亲缘关系较近,与绿鲍亲缘关系较远。从细胞溶素氨基酸比较中发现皱纹盘鲍在第69号位点为苯丙氨酸,正好与其在卵黄膜上的受体VERL 3上第387位点的异亮氨酸形成疏水结构域,而西氏鲍69号位位酪氨酸,不能与异亮氨酸形成疏水结构域,推测这是西氏鲍受精速率比皱纹盘鲍受精速率慢的原因之一。3.细胞溶素的原核表达实验得出:原核表达细胞溶素与天然状况下细胞溶素功能一致,均可以使卵黄膜溶解。为了探究鲍细胞溶素不同区域对受精的影响,本文对鲍细胞溶素不同区域序列进行重组和删除,我们发现细胞溶素的氨基端对其溶解卵黄膜有重要作用,删除或替换将使细胞溶素对卵黄膜的溶解能力极大幅下降或者完全使其不能溶解卵黄膜;改变细胞溶素前中段序列和羧基端序列对其溶解卵黄膜没有显著影响。在溶解实验中我们还发现当卵黄膜被完全溶解,精子粘附将受到影响并导致后续的胚胎发育出现畸形。4.通过对鲍细胞溶素和其在卵黄膜上的受体的差异分析和3D空间模拟,对其可能功能进行了预测和表征。通过与斑马鱼质膜上受体bncr的同源比对中发现,鲍也存在和Ly6/uPAR家族同样的序列,与斑马鱼该序列的相似度达32.7%,推测鲍精卵识别除了细胞溶素对卵黄膜的溶解,还可能与卵子质膜上其他受体相关。
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