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实验目的:通过整体动物模型和体外细胞培养实验,从整体动物、组织器官、细胞和分子水平上观察地黄寡糖对血管性痴呆的预防和治疗作用,并初步探索其可能的作用机制。
实验方法:
1.选择成年SD大鼠,随机分为伪手术组、模型组和地黄寡糖高、低剂量组(9.0、4.5g·Kg-1·d-1以生药量计)。灌胃给药,每日1次,术前预防给药14d,术后再继续给药6d。用反复双侧颈总动脉缺血再灌注配合腹腔注射硝普钠的方法制备血管性痴呆模型,使用Y型迷宫进行被动回避反应和信号方位辨别反应实验,测试各组大鼠的学习记忆能力和信号方位辨别能力的改变。
2.选用SD成年大鼠,随机分为伪手术组、模型组和地黄寡糖高、低剂量组(9.0、4.5g·Kg-1·d-1以生药量计)。灌胃给药,每日1次,术前预防给药14d,术后再继续给药6d.采用双侧颈总动脉缺血再灌注法制作血管性痴呆大鼠模型,采用行为学评分法评价大鼠的行为学障碍程度,HE染色法观察大鼠海马CA1区病理组织形态学变化,TUNEL法检测大鼠海马CA1区的神经元细胞凋亡情况,免疫组化法检测大鼠海马区凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax的表达含量的变化,并检测大鼠海马组织匀浆中神经毒性氨基酸谷氨酸及海马组织和血清中超氧化物歧化酶活性、丙二醛含量。
3.采用0.5mmol/L氯化钴处理PC12细胞24h,建立化学性缺氧诱导的PC12细胞损伤实验模型。采用小、中、大和极大浓度的地黄寡糖药液(5、25、100、400mg/L)进行干预,MTT法检测细胞存活率;LDH试剂盒检测细胞上清液中LDH活力;流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况:并采用酶标仪检测细胞内SOD活力和MDA水平。
4.采用原代培养的方法获取大鼠海马神经元细胞,用0.1mmol/L谷氨酸处理海马神经元24h制备损伤模型。分别采用小、中、大浓度(25、100、400mg/L)的地黄寡糖药液进行干预,MTT法测定细胞的存活率,LDH试剂盒测定细胞上清液中LDH活力,流式细胞仪AnnexinV-FITC/PI双染法观察细胞凋亡情况,并用酶标仪测定细胞中SOD活力和MDA水平。
实验结果:
1.学习记忆实验结果表明,与模型组相比,地黄寡糖给药组能够明显减少实验大鼠达成学会标准所需的训练次数,停止训练一周后,进洞潜伏期明显延长;信号方位辨别实验结果表明,与模型组相比,地黄寡糖给药组大鼠随着训练天数的增加,其正确反应率升高较快,且停止训练一周后,其正确反应率高于模型组。
2.大鼠行为学能力测试结果表明,模型组大鼠行为学评分明显升高,地黄寡糖给药能够显著降低其行为学评分,改善大鼠的痴呆症状:大鼠脑组织HE染色结果表明,地黄寡糖能够改善海马CA1区神经元形态异常;大鼠脑组织TUNEL染色结果表明,地黄寡糖能够改善海马CA1区神经元凋亡情况;大鼠脑组织免疫组化结果表明,地黄寡糖给药能够提高细胞中Bcl-2蛋白表达量,降低Bax蛋白表达。此外,生化检测结果显示地黄寡糖给药能够显著减少血管性痴呆大鼠血清及海马组织中丙二醛的积累,提高超氧化物歧化酶的活性,降低海马组织中谷氨酸的水平。
3.氯化钴可明显抑制PC12细胞的存活率,呈浓度和时间依赖性。地黄寡糖可明显提高氯化钴诱导的PC12细胞损伤模型的存活率,抑制该细胞LDH释放,降低PC12细胞的凋亡百分率,并能改善细胞的氧化还原状态。
4.地黄寡糖可明显提高谷氨酸损伤后海马神经元的存活率,抑制由谷氨酸损伤引起的细胞内LDH的释放,降低细胞凋亡,并能改善细胞的氧化还原状态。
结论:
地黄寡糖能够改善痴呆大鼠的学习记忆能力,并能在离体细胞模型上对抗缺氧和兴奋性毒性损伤,保护神经细胞。其机制可能与抗凋亡、清除自由基,对抗兴性神经毒性相关。提示地黄寡糖是一种有潜力的神经保护物质。