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作为一种重要的转录因子,FOXC1在脊椎动物心脏发生中发挥着关键作用。FOXC1突变与Axenfeld-Rieger（ARS）综合征病人伴有的先天性心脏病（CHD）症状共分离,但迄今无直接功能分析证据支持FOXC1突变是CHD发生的原因。为解析突变FOXC1在CHD中的作用与机制,我们首先使用大鼠心肌细胞系H9c2作为模型研究了FOXC1与NKX2.5之间的调控关系,结果显示FOXC1可以剂量依赖方式通过直接结合在NKX2-5启动子近端的三个经典结合位点激活其表达。这表明我们先前发现的“FOXC1的斑马鱼直系同源基因foxc1a通过直接调控心脏前体细胞标识基因nkx2.5的表达决定斑马鱼心脏发生”的这一机制在哺乳动物心肌细胞系中是保守存在的。基于上述发现,我们用H9c2细胞系检测了8种来自伴有CHD的ARS病人携带的突变FOXC1对NKX2-5的转录调控活性。结果表明:相较于野生型FOXC1,突变的FOXC1（p.R170W）和FOXC1（p.G149D）可异常抑制NKX2-5的转录、FOXC1（p.Q70Hfs*8）和FOXC1（p.S82T）丧失了对NKX2-5的转录激活能力、FOXC1（p.L86F）和FOXC1（p.F112S）则能异常上调对NKX2-5的转录激活,而FOXC1（p.A85P）和FOXC1（p.R127L）不会异常调控NKX2-5的表达。而将这8种突变FOXC1在斑马鱼胚胎中分别过表达后,除FOXC1（p.G149D）外的7种突变FOXC1调控斑马鱼nkx2.5表达的能力与在大鼠心肌细胞系中观测到的结果一致;与在H9c2细胞系中表现出的抑制NKX2-5表达能力完全相反,在斑马鱼胚胎中FOXC1（p.G149D）与野生型FOXC1相比具有更强的激活nkx2.5表达的能力。为确认这些突变FOXC1在CHD发生中的病理学意义,我们在斑马鱼foxc1a敲除胚胎中过表达了两种代表性的突变FOXC1。与各自异常激活与异常抑制nkx2.5表达能力一致,过表达FOXC1（p.R170W）进一步恶化了以心室短轴缩短分数为指标的foxc1a敲除胚胎的心脏功能;而过表达FOXC1（p.G149D）则能很好地拯救胚胎心脏功能。为了解突变FOXC1在散发CHD病人中出现的频率,我们分析了CHD与非CHD流产胎儿的FOXC1基因型,发现两组胎儿中均存在FOXC1（p.G380＿A381ins G）和FOXC1（p.G456＿Q457ins G）两种疑似多态性的“突变”。与过表达野生型FOXC1相比,在大鼠心肌细胞系中过表达这两种“突变”FOXC1均导致NKX2-5启动子转录活性异常上调,而在斑马鱼胚胎中过表达这两种“突变”FOXC1则与过表达野生型FOXC1具有相同的上调胚胎nkx2.5表达的能力。与在斑马鱼胚胎中获得的评价结果一致的是,在非CHD流产胎儿和患有CHD的流产胎儿组中,NKX2-5在各种FOXC1基因型样本中表达量没有显著的统计学差异。为进一步确认细胞系模型评价人突变基因功能结果与临床特征的不一致性,我们选择在人胚肾上皮细胞系HEK293T重复突变FOXC1功能的评价实验。结果显示,与在H9c2细胞系中发挥的作用相反,FOXC1在HEK293T中以剂量依赖方式抑制NKX2-5的启动子活性。为揭示造成这种不同效应的机制,我们比较了H9c2和HEK293T两种细胞系的转录组数据,发现有30个转录因子特异地在H9c2中表达,其中的Hoxc11独立于FOXC1通过自身的HOX结合域直接结合到NKX2-5启动子上至少5个结合位点调控其在H9c2细胞中的表达。为探究在大鼠细胞系中发现的Hoxc11可直接调控NKX2-5基因表达的这一机制在体内是否保守存在,我们运用CRISPR/Cas9技术创建了其在斑马鱼中的两个直系同源基因hoxc11a和hoxc11b的基因敲除突变体。与未发现二者在发生中的心脏内有表达相一致的是,hoxc11a和hoxc11b单基因敲除斑马鱼胚胎发育、生长、以及繁育均正常。由于RT-PCR检测显示hoxc11a和hoxc11b在成体斑马鱼心脏中有表达,我们进而对hoxc11a和hoxc11b单基因敲除体与野生型同胞的成体心脏转录组分别进行了比较分析,结果显示差异表达基因中没有nkx2.5,定量RT-PCR结果支持这一结论。另一方面,在hoxc11a基因敲除的成年斑马鱼心脏中未见hoxc11b的上调,反之亦然;表明在成鱼心脏中hoxc11a和hoxc11b之间并不存在基因功能补偿作用,此与双纯合突变体能正常存活相一致。这些实验结果提示在大鼠心肌细胞系H9c2上发现的Hoxc11直接调控NKX2-5表达的这一分子生物学过程并不存在于动物个体发生与生长中。综上所述,本论文的研究表明与临床分子生物学数据相比,以斑马鱼模型评价FOXC1突变基因功能获得的结果比细胞系模型获得的结果更具一致性。伴CHD的ARS病人携带的突变FOXC1（p.R170W）可能通过异常抑制NKX2-5的转录、FOXC1（p.Q70Hfs*8）和FOXC1（p.S82T）通过丧失对NKX2-5的转录激活、FOXC1（p.G149D）和FOXC1（p.L86F）以及FOXC1（p.F112S）则可通过异常升高对NKX2-5的转录激活参与CHD的发生,而突变FOXC1（p.A85P）和FOXC1（p.R127L）连同在散发的CHD病人中发现的两种疑似多态性的“突变”FOXC1（p.G380＿A381ins G）和FOXC1（p.G456＿Q457ins G）至少不会通过异常调控NKX2-5的表达参与CHD的发生。