苹果酒是以纯苹果汁为原料发酵而成的饮料酒,既具有苹果汁的风味,又具有酒的芳香,已逐渐成为我国果酒消费的主要产品,而且其产业发展符合“粮食酒向水果酒转变”的国家发展战略。我国作为世界上第一大苹果生产国,苹果酒不仅可使大量苹果转化增值,还可满足人们对低度果酒的消费需求,是我国苹果产业未来的发展方向。但目前我国苹果酒酿造缺乏专业的产香酵母,同时对酿造过程中酵母菌的产香调控机制研究不够深入。本研究以课题组利用原生质体融合培育的38号苹果酒酵母菌为原始菌株,通过PCR技术构建了BAT2基因敲除片段,敲除38号酵母的BAT2基因并获得了38(?BAT2)苹果酒酵母基因工程菌株。以38号和38(?BAT2)酵母为发酵菌株,在SCD培养基中分别添加0.5M和1.0M的异亮氨酸或亮氨酸为中心氮源进行发酵试验,利用RP-HPLC柱前衍生法分析了不同发酵时间两种支链氨基酸的消耗量,通过固相顶空微萃取-气相质谱联用(HS-SPME-GC-MS)同步分析了异亮氨酸和亮氨酸消耗的主要阶段各发酵产物中挥发性香气成分种类和产量,运用MM2力场对代谢物路径进行了能量代谢分析,通过比色法同步分析了发酵液中酵母细胞的转氨酶活性,通过DNS法同步分析了发酵过程中葡萄糖的消耗量。论文得到的主要结果和结论如下:(1)短侧翼同源区PCR法敲除酵母BAT2基因的步骤简单、周期短,成本低。(2)高浓度的异亮氨酸或亮氨酸并不对酿酒酵母生长产生毒性。在对数生长期12h内,98%的氨基酸被消耗分解;添加氨基酸的消耗速率与其添加的初浓度成正比。染色体中BAT2基因缺失对支链氨基酸的消耗速率没有显著影响,12h酵母的电镜照片表明BAT2基因缺失时线粒体可能是所添加氨基酸分解的主要场所。(3)在氨基酸消耗的主要阶段,GC-MS同步分析结果表明,在异亮氨酸和亮氨酸为中心氮源的12h发酵液中分别有35和33种挥发性香气物质。在这些挥发性香气代谢物中,两中心氮源发酵产物在物质种类上的区别是异亮氨酸代谢产生了2-甲基丁醛、2-甲基丁醇和乙酸2-甲基丁酯,而亮氨酸代谢产生了3-甲基丁醛、3甲基丁醇和乙酸3-甲基丁酯,这些都是发酵酒中重要的指标性香气物质。两种支链氨基酸的添加均使产物中2-甲基1-丙醇产量呈正相关增加。在添加两种氮源的SCD培养基的挥发性代谢产物中发现了C8(辛醛、辛醇、辛酸、辛酸乙酯)、C9(壬醛和壬醇)、C10(癸醛、癸酸和癸酸乙酯)、C12(十二醛、十二醇和十二酸)、C14(十四醇、十四酸乙酯、十四酸异丙酯)、C16(十六醇、十六酸甲酯、十六酸乙酯和十六酸异丙酯)等支链代谢路径,通过分析发现每个支链代谢路径一般包含一对并行的醛转化为酸和醇的氧化还原反应来维持NAD+/NADH的氧化还原平衡,还包含一个酯化反应来储藏过剩能量并维持能量平衡的过程。其中脂肪醛形成脂肪醇或脂肪酸的过程一般是一个释放能量的自发过程,脂肪醇和脂肪酸的酯化反应过程则是一个吸收过剩能量的非自发过程。BAT2基因与添加的异亮氨酸或亮氨酸联合调控其中的某些代谢物。在两酵母菌株分解两种支链氨基酸的主要阶段,谷氨酰胺的产量随两氨基酸消耗量的增大而增大,表明酵母细胞分解高浓度支链氨基酸时的脱氨路径可能是将氨基先转移给ɑ-酮戊二酸生成谷氨酸,谷氨酸进一步接受氨基后生成了谷氨酰胺。(4)两株酵母菌的支链氨基酸转氨酶活性分析结果表明,在氨基酸消耗的主要阶段BAT2基因缺失没有显著影响酵母细胞的支链氨基酸转氨酶活性。(5)添加异亮氨酸或亮氨酸的SCD培养基发酵达到残糖浓度的时间比对照组均推迟了约24h。本研究所获得的上述成果为深入研究苹果酒酵母的香气调控提供了理论依据,对于苹果酒产业发展也有重要的借鉴意义。