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子宫肌瘤是女性生殖系统常见肿瘤,其发病率呈逐年上升趋势,具体发病机制尚未完全明确。子宫肌瘤发展至出现临床症状与其体积逐渐增大密切相关,在这个过程中发挥关键作用的不是肌瘤细胞的快速增殖,而是肿瘤微环境中ECM的过度累积。近年来的研究提出在促炎性反应及促纤维化介质的作用下,子宫肌瘤主要呈现为一种纤维化疾病的进展。纤维化疾病的特征为ECM的异常沉淀。ECM主要由成纤维细胞分泌,病理因素作用下成纤维细胞转分化为成肌纤维细胞,表现为合成细胞外基质的能力较成纤维细胞明显增强,同时能产生多种细胞因子、生长因子和炎性递质。ET-1是人体组织中广泛存在的细胞因子,不仅可以刺激血管收缩,也参与炎症因子网络的调节,与瘢痕形成以及心、肺、肾等重要脏器纤维化的发生密切相关。目前的研究显示,ET-1对子宫肌瘤细胞增殖及凋亡有影响,但是在子宫肌瘤纤维化过程中,ET-1是否对成纤维细胞转分化为成肌纤维细胞产生重要作用,从而影响ECM累积,同时对重要的纤维介质TGF-β1诱导的成纤维细胞转分化是否有影响尚无相关研究。第一部分子宫肌瘤中成肌纤维细胞的原代分离培养及鉴定收集2011年9月至2012年6月重庆医科大学附属第一医院妇科人子宫肌瘤标本、因宫颈上皮内瘤变行子宫全切的正常子宫肌层组织标本各30例,患者年龄为32-49岁,均为已育绝经前女性,术前6个月未接受激素药物治疗。HE染色观察标本组织特点,采用免疫荧光三标鉴别正常子宫肌层与肌瘤组织中成肌纤维细胞的差异,并对人子宫肌瘤组织中的成肌纤维细胞进行原代分离培养,免疫细胞化学法对培养的细胞进行鉴定。实验结果显示,标本符合子宫肌瘤和正常子宫肌层组织学特征,组织免疫荧光三标证实在子宫肌瘤组织中成肌纤维细胞数较正常子宫肌层多,具有统计学意义(P<0.05)。子宫肌瘤组织成肌纤维细胞原代分离培养成功,免疫细胞化学结果显示所培养的细胞呈Vimentin、α-SMA阳性表达,H-Caldesmon阴性表达,证实为成肌纤维细胞。ECM的过度累积是子宫肌瘤逐渐增大过程中的主要原因之一,成肌纤维细胞则是ECM分泌合成的主要来源。结论:本部分研究结果证实子宫肌瘤中成纤维细胞向成肌纤维细胞的转化较正常子宫肌层明显活跃,可能是子宫肌瘤发展过程中的关键因素之一。第二部分ET-1对人子宫肌层成纤维细胞转分化作用的影响收集2011年9月至2012年6月本院妇科因宫颈上皮内瘤变行子宫全切的正常子宫肌层组织10例。患者年龄为32-49岁,绝经前女性,无子宫肌瘤及子宫恶性肿瘤,且近6月未行激素治疗。进行人子宫肌层成纤维细胞原代分离培养,采用免疫细胞化学法鉴定。将原代细胞分为实验组和对照组,实验组给予不同浓度不同浓度的ET-1(0.1、1、10、100nmol/L)作用24h,另以10nmol/L ET-1分别作用6、12、24、48h,以及10nmol/L ET-1、10μg/L TGF-β1、10nmol/L ET-1+10μg/LTGF-β1作用组,均以正常培养的细胞作对照。采用荧光定量PCR及Western blot检测成肌纤维细胞标志蛋白α-SMA mRNA和蛋白的表达。实验结果显示人子宫肌层成纤维细胞形态呈梭形,多突起,胞核呈扁卵圆形,免疫细胞化学检测显示,细胞的α-SMA蛋白染色呈阴性,波形蛋白(Vimentin)染色呈阳性,符合成纤维细胞蛋白标志物特征,原代培养成功。RT-qPCR和Western blot结果显示,0.1、1、10、100nmol/L ET-1作用的人子宫肌层成纤维细胞均有α-SMAmRNA和蛋白的表达,与未予ET-1处理的对照组相比,表达水平差异具有统计学意义(P <0.05);10nmol/L处理组的mRNA和蛋白表达水平最高,与0.1、1nmol/L组比较差异有统计学意义(P <0.05),与100nmol/L处理组比较mRNA和蛋白表达差异均无统计学意义(P>0.05)。经ET-1(10nmol/L)作用6,12,24,48h的人子宫肌层成纤维细胞,采用RT-qPCR和Western blot检测显示,均有α-SMAmRNA和蛋白的表达,与未予ET-1处理的正常培养对照组相比,在mRNA和蛋白水平差异均有统计学意义(P <0.05);其中以作用48h组α-SMAmRNA和蛋白的表达量最高,与6、12、24组比较,mRNA和蛋白表达差异均有统计学意义(P <0.05)。经10nmol/L ET-1、10μg/L TGF-β1、10nmol/L ET-1+10μg/LTGF-β1作用的人子宫肌层成纤维细胞,采用RT-qPCR和Western blot检测显示,均有α-SMAmRNA和蛋白的表达,与未予特殊处理的正常培养对照组相比,在mRNA和蛋白水平差异均有统计学意义(P <0.01);其中10nmol/L ET-1+10μg/L TGF-β1作用组mRNA和蛋白表达量均最高,与10nmol/L ET-1作用组及10μg/L TGF-β1作用组相比,mRNA和蛋白差异均有统计学意义(P <0.01)。结论:ET-1可诱导子宫肌层成纤维细胞向成肌纤维细胞转分化,最适浓度可能为10nmol/L;ET-1与TGF-β1诱导成纤维细胞向成肌纤维细胞的转分化可能存在协同作用。第三部分ET-1促进TGF-β1诱导成纤维细胞转分化的可能机制研究原代人子宫肌瘤成肌纤维细胞感染靶向ET-1基因沉默的shRNA慢病毒包装质粒,观察细胞转染效率、筛选干扰效果最佳的ET-1shRNA和最佳感染复数后。采用荧光定量PCR及Western blot检测LV-ET-1shRNA作用前后子宫肌瘤成肌纤维细胞ET-1、 α-SMA、TGF-β1、Smad2、Smad3mRNA和蛋白以及p-Smad2、p-Smad3蛋白的表达变化。实验结果显示Western blot检测3个siRNA干扰序列对ET-1基因的沉默效应,以LV-shRNA1下调ET-1蛋白表达最为明显,与另外两个干扰序列及空白对照组和阴性对照组差异有统计学意义(P <0.05)。采用荧光定量PCR检测shRNA1干扰后人子宫肌瘤成肌纤维细胞α-SMA、TGF-β1、Smad2、Smad3的表达,结果显示较空白对照组以及阴性对照组,干扰组α-SMA、TGF-β1、smad2、smad3mRNA表达水平均降低,差异有统计学意义(P <0.01)。采用Western blot检测shRNA1干扰后人子宫肌瘤成肌纤维细胞α-SMA、TGF-β1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3蛋白表达水平,结果显示较空白对照组以及阴性对照组,干扰组ET-1、α-SMA、TGF-β1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3蛋白表达水平均降低,差异有统计学意义(P <0.05)。结论:干扰ET-1的活性可抑制α-SMAmRNA和蛋白的表达水平,可能逆转成纤维细胞向成肌纤维细胞的转分化;ET-1促进TGF-β1诱导成纤维细胞向成肌纤维细胞分化的作用,可能通过调节Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3表达水平来实现。