林可霉素(Lincomycin)及其衍生物是一类在临床上广泛应用的林可酰胺类抗生素,主要用于治疗革兰氏阳性菌引起的感染。由于林可霉素具有很重要的药用价值和经济价值,提高林可霉素产量始终是科研人员和企业家关注的焦点。近年来己从两个方面研究取得重要进展,一是通过发酵工程优化其生产工艺；二是通过基因工程途径改良菌种。前者提高产量有限,而且也渐入瓶颈,后者具有更大的提升产量潜力,是人们一直关注的焦点。林可霉素生物合成基因簇中存在三个抗性基因lmrA、 lmrB和lmrC,其中lmrA和lmrC是可能的转运蛋白基因。通过生物信息学分析,LmrA是具有14次跨膜结构的MFS超家族的转运蛋白,与抗生素运输有关；LmrC属于ABC转运蛋白家族,但其不含跨膜的结构,只编码ABC转运蛋白的ATP结合结构域；而LmrB与AdoMet_MTases超家族成员有着很高的同源性,该家族的酶主要是在23SrRNA的2058位腺嘌呤的N6位进行单或双甲基化作用,推断LmrB可能是通过修饰23S RNA使其与林可霉素结合能力减弱而产生抗性。因此,林可链霉菌很可能存在着rRNA的甲基化修饰降低产物亲和力与产物外排这两种林可霉素抗性机制,但迄今并没有进行深入的功能研究。本课题以林可链霉菌中林可霉素生物合成抗性基因的功能研究为切入点,为最终构建林可霉素高抗高产的衍生菌株奠定了基础。首先,通过同源重组在林可霉素高产菌株林可链霉菌LC-G中构建了ImrA缺失突变株XJJ4。在工业培养基中发酵时,相比出发菌株LC-G,XJJ4的林可霉素产量下降了75%。抗性检测显示XJJ4耐受林可霉素的最高浓度降低了约九倍。通过实时荧光定量PCR分析发现,突变株XJJ4中林可霉素生物合成基因lmbA、lmbR和调控基因lmbU的转录均明显低于LC-G。另外我们构建了lmrA回补菌株XJJ5,其林可霉素产量回补到了LC-G的42%。进一步在LC-G中构建了lmrA过表达菌株XJJ6,并进行了林可霉素产量、抗性及其生物合成基因的转录分析,相比LC-G中转入空载的菌株XJJ2, XJJ6的产量提高了29%,耐受林可霉素的最高浓度提高了约八倍,并且在XJJ6中,lmrA的转录提高了20～30倍的同时,林可霉素生物合成基因lmbA、lmbR和调控基因lmbU的转录均明显升高。这些结果显示LmrA是一个负责林可霉素运输的转运蛋白,可通过影响林可霉素生物合成的结构基因和调控基因的转录而实现的,因此LmrA不仅具有通过外排林可霉素产生抗性的能力,还能通过增加林可霉素的外排进一步提高产量。其次,通过同源重组在林可霉素高产菌株林可链霉菌LC-G中构建了lmrC缺失突变株XJJ7。高效液相色谱分析和抗性检测显示,相比出发菌株LC-G,XJJ7的林可霉素产量下降了55%,而且耐受林可霉素的最高浓度降低了约一倍。通过实时荧光定量PCR分析发现,突变株XJJ7中林可霉素生物合成基因lmbA口lmbR的转录均明显低于LC-G,但调控基因lmbU没有变化。构建的lmrC回补菌株XJJ8的林可霉素产量回补到了LC-G的55%。进一步在LC-G中构建了lmrC过表达菌株XJJ9,并进行了林可霉素产量、抗性及其生物合成基因的转录分析,相比LC-G中转入了空载的菌株XJJ2,XJJ9的产量没有提高,但耐受林可霉素的最高浓度提高了约两倍,并且林可霉素生物合成基因lmbA、 lmbR和调控基因lmbU的转录均没有明显变化。这些结果暗示lmrC编码的ABC转运蛋白ATP结合亚基,作为抗生素非特异性的外运蛋白,很可能林可链霉菌基因组中编码的ABC转运蛋白跨膜亚基形成二聚体,行使其转运活性。因此,在体外高浓度的林可霉素环境下,LmrC可充分发挥其转运能力并外排进入胞内的林可霉素；而当菌体内林可霉素的浓度较低时,即使lmrC的过表达也难以进一步提高林可霉素产量。此前,我们通过林可霉素野生型与高产工业菌株的比较基因组分析,发现LC-G中的lmrB缺失了156个碱基,很可能影响了产生菌的抗性与产量。通过Redirect技术在野生菌中缺失了lmrB基因。同时,我们将来源于野生菌中的lmrB基因在LC-G进行表达,以考察能否进一步提高产量。目前这些突变株的产量分析实验正在进行之中。本研究一方面通过同源重组的方法在LC-G中对lmrA和lmrC基因进行中断,以及并对这两个基因过表达,进行林可霉素产量、抗性及生物合成基因转录的分析,研究这些基因的功能以及与产量的关系。另一方面通过Redirect技术在野生菌中缺失lmrB基因并在高产菌中过表达了野生型的lmrB基因,初步研究该基因功能。本研究为获得高产高抗菌株开拓了视野,为实际工业生产提供了重要理论基础。