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流行性乙型脑炎是由黄病毒科的乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis viruses. JEV)引起的蚊媒性人兽共患病,能够引起人严重的中枢神经系统病变。猪为JEV的主要扩增宿主,猪流行性乙型脑炎与人流行性乙型脑炎密切相关,因此预防猪感染本病既是减少养猪业损失,也是防止人患乙脑的重要措施。四川省是全国乙型脑炎高发省份,近年来发病率在2/10万～10/10万之间。本次研究建立了一套乙型脑炎RT-PCR检测方法并运用该方法对四川地区乙脑病毒进行了分子流行病学调查,掌握了四川部分地区乙型脑炎病毒的分子生物学特征与变异情况,为四川地区流行性乙型脑炎病毒的预防监控、分子生物学研究与DNA疫苗的研制提供重要依据。1.乙型脑炎病毒分子流行病学调查方法的建立本次研究参考GenBank中收录的31株乙脑病毒基因序列,找出序列保守区,确定基因组240-993区段为扩增靶序列,以疫苗株SA14-14-2为参照设计引物,通过试剂浓度、退火温度与延伸时间等条件的优化,建立了一套乙脑RT-PCR检测方法。以蓝耳病病毒、猪瘟与猪轮状病毒为对照的特异性实验以及临床检测证明该检测方法确实有效,且有较高的特异性。敏感性实验结果显示该方法可以检测出的最低RNA模板浓度为122ng/mL,说明其敏感性较好,可用于猪乙型脑炎病毒临床的快速检测和乙型脑炎病毒的分子流行病学调查。2.四川地区乙型脑炎病毒的分子流行病学调查在四川省14个地区(成都、雅安、泸州、彭州、都江堰、遂宁、南充、广安、广元、巴中、达州、内江、德阳)共包括21个县(区)的27个规模化猪场与散养户采集了猪流产死胎脑组织样品与各类蚊虫样品共53份,并将采集样品按猪源、蚊源及蚊虫种类进行分类。运用建立的RT-PCR检测方法对53份样品进行检测,结果显示采自南充、泸州、彭州、都江堰、广安、雅安等地的9份样品呈阳性。该9份样品中8份来源于蚊虫,1份来源于猪流产死胎脑组织。克隆出该9份乙脑病毒的PrM基因与6份E基因,再加上1份实验室以前克隆的乙脑病毒基因一并测序,序列分析结果显示本次研究的乙脑病毒的PrM基因和E基因在核酸与氨基酸序列上与现用疫苗株具有很高的同源性,基因分型结果显示其中9株病毒为基因Ⅲ型乙脑病毒,1株为基因Ⅰ型,且与中国以往分离的四川毒株遗传进化关系最近,具有明显地域性。