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目的铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PAE)为条件致病菌，分布广泛，在正常情况下不致病。但当人体免疫力降低时(如：长期应用激素、肿瘤化疗、AIDS)或严重创伤(如大面积烧伤、大型手术)或医疗操作(如气管切开、插管)后，PAE引起的感染性疾病不断增加。随着抗生素的广泛使用，耐药铜绿假单胞菌的发生率增多，特别是多重耐药菌，使临床上治疗该病原菌引起的相关感染变得越来越来困难。然而传统的细菌学检查方法时间长、敏感性低，一直不能满足临床诊治的需求。因此建立了一种新的、简单、快速的现场检测方法，对铜绿假单胞菌及耐药性的早期诊断和治疗具有重大意义。本研究目的：了解临床标本中分离的铜绿假单胞菌对16种抗菌药物的耐药情况，为临床合理使用抗生素提供参考。对多重耐药铜绿假单胞菌进行相关耐药基因的研究。建立一种基于颜色判定的，能够快速准确地检测铜绿假单胞菌及其OprD2耐药基因的LAMP方法。方法对临床收集47株耐药铜绿假单胞菌采用K-B纸片扩散法测定对庆大霉素等16种抗菌药物的敏感性。PCR扩增检测收集的铜绿假单胞菌标本中的耐亚胺培南类IMP、VIM、GES、GIM、OXA-10、OprD2耐药基因。针对铜绿假单胞菌OprL、OprD2基因设计LAMP引物,通过引物特异性识别OprL、OprD2的6个独立区域来快速检测铜绿假单胞菌特有OprL基因和OprD2耐药基因。如果在反应前添加荧光染料羟基萘酚蓝(HNB)或钙黄绿素(Calcein)，其结果可以通过肉眼观察反应前后颜色变化来判定并经琼脂糖凝胶电泳验证。对该技术进行特异性、灵敏度分析，用LAMP扩增法、PCR扩增法和临床传统方法同时检测临床标本。结果1.47株耐药PAE对头孢噻肟耐药率最高占97.87%，左旋氧氟沙星耐药率占40.42%，氨曲南耐药率占38.30%，哌拉西林耐药率34.04%，美罗培南耐药率占29.79％，亚胺培南、环丙沙星、头孢哌酮的耐药率占27.66％。2.47株PAE中VIM基因阳性12株，阳性率25.53%，OXA-10基因阳性2株，阳性率4.26%，OprD2基因缺失23株，缺失率占48.94%，而IMP、GIM、GES基因均阴性。OprD2基因缺失株的头孢噻肟、左氧氟沙星、氨曲南、哌拉西林、亚胺培南和美罗培南耐药率分别为100%(23/23)、56.52%(13/23)、47.83%(11/23)、47.83%(11/23)、47.83%(11/23)和43.48%(10/23)。统计学分析结果显示：与OprD2基因阳性株相比，OprD2基因缺失株的亚胺培南、左旋氧氟沙星、美洛培南耐药比例明显升高(卡方值为9.155、4.846、4.037，P值为0.002、0.028、0.045，差异有统计学意义)。3.设计出针对铜绿假单胞菌OprL基因、OprD2耐药基因可直接肉眼判读结果的等温扩增检测方法。本等温扩增检测法只扩增铜绿假单胞菌，对其他菌不扩增，显示出良好的特异性。其最低检测限为17.414pg/μl, PCR方法最低检出限为174.414pg/μl, LAMP方法检测灵敏度是PCR方法检测灵敏度的10倍,灵敏度高。LAMP法与PCR法对临床铜绿假单胞菌OprL基因和OprD2耐药基因检出率相当。结论1．临床铜绿假单胞菌耐药情况严重，耐药铜绿假单胞菌OprD2基因缺失较为普遍，47株中缺失23株占(48.94%)。OprD2基因缺失导致铜绿假单胞菌以亚胺培南为主的耐药，因此明确OprD2基因分布状况有助于临床抗菌药物的选用。2．LAMP方法用于快速检测铜绿假单胞菌具有检测过程简单、实验装置简便、反应结果肉眼可辨别、灵敏度高和特异性强等特点，特别适合用于现场和基层检疫及医疗单位的快速诊断。本课题成功建立针对铜绿假单胞菌OprL基因及其OprD2耐药基因可直接肉眼判读检测结果的LAMP技术。