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背景和目的急性肺损伤（Acute lung injury,ALI）及其更严重的形式急性呼吸窘迫综合征（Acute respiratory distress syndrome,ARDS）是由多种因素引起的肺部急性炎症,主要表现为弥漫性肺泡损伤及上皮细胞功能障碍。近年来,急性肺损伤的发病率不断增加,死亡率达到30~40%,尽管临床上常用地塞米松、泼尼松等具有抗炎作用的药物治疗急性肺损伤,但因其副作用明显,极大地限制了药物的应用。若急性肺损伤的炎症不受控制,组织发生反复的损伤和修复,长期则可发展为肺纤维化（Pulmonary fibrosis,PF）。肺纤维化是由肺泡上皮细胞反复发生损伤、成纤维细胞增殖、胶原蛋白和其他细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）过度沉积而引起的间质性肺部疾病,患者5年生存率仅为20%。目前用于特发性肺纤维化的药物吡非尼酮和尼达尼布仅能延缓肺纤维化的进展,且因其作用机制尚未完全清晰,价格昂贵和用药后腹泻呕吐等原因,其应用也受到限制。因此当前迫切需要寻找更安全有效的治疗急性肺损伤和肺纤维化的药物。唐草片（Tangcao Pian）是我国第一个,也是目前唯一一个获得国家食品药品监督管理局颁发新药证书,并获准上市的辅助治疗艾滋病的纯中药制剂。目前关于唐草片对肺部重度炎症性疾病的治疗作用研究鲜有报道,但唐草片中多种中药成分（如老鹳草、金银花、柴胡等）均被证实具有显著的抗炎作用,而且动物实验证明唐草片可有效调节免疫低下肺部感染小鼠的炎性细胞因子的分泌。基于此,本课题组建立了LPS诱导的小鼠急性肺损伤和肺纤维化模型,研究唐草片对以炎症反应为主要特征的急性肺损伤和其后期发展阶段肺纤维化的作用及其作用机制。方法1急性肺损伤小鼠模型的建立随机将雄性BALB/c小鼠分为对照组、假手术组、模型组和唐草片各剂量组（0.25 g/kg,0.5 g/kg,1 g/kg,2 g/kg）。将模型组和唐草片组小鼠气管滴注LPS（4 mg/kg）,假手术组气管滴注等体积生理盐水。从造模前5天开始,唐草片组每天以不同剂量灌胃给药,对照组、假手术组和模型组灌胃等体积0.5%羧甲基纤维素钠溶液,造模24 h后处死动物。气管滴注LPS（20 mg/kg）用于观察急性肺损伤小鼠14天内的生存情况。2急性肺损伤小鼠的标本检测摘取肺脏称量肺湿重,肺组织烘干至恒重后称量肺干重,计算肺组织湿/干重比（Wet/dry weight,W/D）,根据不同剂量组唐草片对肺水肿的减轻情况筛选给药剂量;H＆E染色观察肺组织病理变化;分别采用ELISA法和Western Blot法检测小鼠血清和肺组织中白介素-6（Interleukin-6,IL-6）,IL-1β及肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）的表达;髓过氧化物酶（Myeloperoxidase,MPO）免疫组化染色观察肺组织中性粒细胞浸润;分别采用伊文思蓝染液渗漏实验和VE-cadherin免疫组化染色检测血管内皮通透性;分离外周血中性粒细胞,Western Blot法检测中性粒细胞趋化因子受体-2（CXC receptor 2,CXCR2）,中性粒细胞弹性蛋白酶（Neutrophil elastase,NE）和GSDMD-N的表达;免疫组化染色检测肺组织GSDMD的表达。3肺纤维化小鼠模型的建立与筛选随机将雄性BALB/c小鼠分为对照组和以下三种模型组,通过肺系数和Masson染色评估三种模型的纤维化严重程度筛选出最佳造模方式。筛选模型后,以该种方式造模,唐草片各剂量组在造模前5天开始灌胃给药,对照组和模型组以0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃,直至动物处死。模型-1:在第1天气管滴注LPS 4 mg/kg,第35天处死小鼠。模型-2:在第1天气管滴注LPS 4 mg/kg,在第7,14,21天腹腔注射LPS 4mg/kg,第35天处死小鼠。模型-3:在第1和14天气管滴注LPS 4 mg/kg,第35天处死小鼠。4肺纤维化小鼠的标本检测H＆E及Masson染色观察肺组织病理改变及胶原沉积;碱水解法检测肺组织中羟脯氨酸（Hydroxyproline,HYP）的含量;Western Blot法检测E-cadherin、α-平滑肌肌动蛋白（α-Smooth muscle actin,α-SMA）以及转化生长因子-β1（Transforming growth factor-β1,TGF-β1）和p-Smad2的表达情况;制备肺组织匀浆测定氧化应激相关指标丙二醛（Malondialdehyde,MDA）,过氧化氢酶（Catalase,CAT）和还原型谷胱甘肽（Glutathione,GSH）的含量。5统计学分析使用SPSS 20.0软件对数据进行统计学处理,Graphpad Prism 8.4.2对数据进行绘图,Image-Pro Plus软件对免疫组化染色阳性区域进行统计,正态分布数据采用Mean±SD表示,P＜0.05具有统计学意义。结果1唐草片对LPS诱导的小鼠急性肺损伤的影响1.1唐草片对急性肺损伤小鼠肺水肿的影响及给药剂量的筛选与对照组相比,模型组小鼠术后精神萎靡,活动量减少,肺系数和W/D显著升高;唐草片用药后上述症状明显减轻,各剂量组肺系数和W/D均有不同程度的降低,其中0.5 g/kg和1 g/kg组与模型组相比具有显著的统计学意义（P＜0.05）。表明唐草片可减轻小鼠的肺水肿,0.5 g/kg和1 g/kg可作为急性肺损伤小鼠的治疗剂量。1.2唐草片对急性肺损伤小鼠生存期的影响模型组小鼠14天内的平均生存时间为7.3天,存活率仅为33.3%;唐草片（0.5 g/kg）和唐草片（1 g/kg）组平均生存时间可达10~12天,存活率分别达到66.7%和77.8%（P＜0.05）,且唐草片（1 g/kg）组小鼠第4~10天体重显著高于模型组（P＜0.05）。提示唐草片可降低大剂量LPS诱发的急性肺损伤小鼠的死亡率,延长生存时间,增加小鼠体重,改善生存状况。1.3唐草片对急性肺损伤小鼠肺组织病理变化的影响与对照组相比,模型组小鼠肺组织结构紊乱,肺泡壁增厚,并伴有充血水肿及炎性细胞浸润等表现;唐草片（1 g/kg）组肺泡壁变薄,肺水肿减轻,炎性细胞浸润减少。提示唐草片可显著减轻急性肺损伤小鼠的病理改变。1.4唐草片对急性肺损伤小鼠促炎细胞因子表达的影响与对照组相比,模型组血清和肺组织中促炎细胞因子IL-6,IL-1β和TNF-α水平显著升高（P＜0.01）;与模型组相比,唐草片（1 g/kg）组上述炎性因子表达均显著降低（P＜0.05）。提示唐草片可减少急性肺损伤小鼠的全身及肺部的炎症反应。1.5唐草片对急性肺损伤小鼠血管内皮通透性的影响与对照组相比,模型组小鼠肺组织的伊文思蓝染液渗漏显著增加,VEcadherin免疫组化染色阳性区域百分比显著降低（P＜0.001）;与模型组相比,唐草片（1 g/kg）组伊文思蓝染液渗出减少,VE-cadherin增加（P＜0.05）。提示唐草片可通过减少VE-cadherin的降解,减轻血管内皮屏障功能受损。1.6唐草片对急性肺损伤小鼠中性粒细胞的影响与对照组相比,模型组小鼠肺组织MPO和GSDMD免疫组化阳性区域百分比及外周血中性粒细胞的CXCR2,NE和GSDMD-N的表达显著升高（P＜0.05）;唐草片（1 g/kg）组以上指标均显著降低（P＜0.05）。提示唐草片可以减少中性粒细胞浸润,抑制其趋化性、脱颗粒和焦亡,减轻LPS诱导的急性肺损伤。2唐草片对LPS诱导的小鼠肺纤维化的影响2.1小鼠肺纤维化模型的建立与筛选与对照组相比,LPS诱导的三种小鼠肺纤维化模型的肺系数和Masson染色的胶原阳性区域百分比均有不同程度的增加,其中模型3肺系数升高最显著,胶原阳性区域百分比最大（P＜0.01）,因此选择模型3（即分别在第1和14天气管滴注LPS 4 mg/kg）为后续实验的造模方式。2.2唐草片对肺纤维化小鼠组织病理变化及肺纤维化程度的影响与对照组相比,模型组小鼠肺组织出现纤维化团块,ECM增多,并伴有炎性细胞浸润,Masson染色阳性区域百分比和HYP含量显著升高（P＜0.01）;唐草片（1 g/kg）可显著减轻肺组织病理变化,减少胶原沉积和HYP含量（P＜0.05）。2.3唐草片对肺纤维化小鼠上皮间质转化的影响与对照组相比,模型组小鼠肺组织中上皮细胞标志物E-cadherin的表达显著下调,间充质细胞标志物α-SMA、纤维化诱导因子TGF-β1和p-Smad2水平显著升高（P＜0.05）;与模型组相比,唐草片（1 g/kg）组E-cadherin的表达明显增加,α-SMA、TGF-β1和p-Smad2的表达明显降低（P＜0.05）。提示唐草片可通过抑制TGF-β1/Smad2信号通路减少上皮间质转化,减轻小鼠的肺纤维化。2.4唐草片对肺纤维化小鼠氧化应激水平的影响与对照组相比,模型组小鼠肺组织的脂质过氧化物MDA水平显著升高（P＜0.05）,抗氧化剂CAT和GSH水平显著减低（P＜0.01）;与模型组相比,唐草片（1 g/kg）组小鼠肺组织的MDA水平下降（P＜0.05）,CAT和MDA水平升高（P＜0.05）。提示唐草片可以降低肺纤维化小鼠的氧化应激水平。结论1.唐草片能显著减轻LPS诱导的小鼠急性肺损伤,其机制可能与保护血管内皮屏障功能和抑制中性粒细胞的致炎作用有关。2.唐草片能显著减轻LPS诱导的小鼠肺纤维化,其机制可能与抑制TGF-β1/Smad2信号通路减少上皮间质转化和降低氧化应激水平有关。