论文部分内容阅读
稻瘟菌引起的稻瘟病是影响世界水稻产量的三大病害之一。在稻瘟菌侵染循环中需要适应各种环境,pH是非常重要的一方面。系统地研究稻瘟菌如何响应和适应环境或寄主的pH环境,具有重要的理论意义和应用价值。本课题首先分析了不同pH条件对稻瘟菌野生型菌株P131生长发育和附着胞形成等过程的影响;然后以实验室前期研究获得的酸性pH敏感型突变体为材料,鉴定出一些稻瘟菌酸性pH响应基因;通过对这些基因进行功能注释,初步明确了可能参与酸性pH响应的生物学过程;通过对酸性pH响应基因的敲除体进行表型分析,明确了它们的生物学功能;最后初步鉴定钙离子信号途径为参与稻瘟菌酸性pH响应的信号途径之一。 首先,分析了不同pH条件对稻瘟菌野生型菌株P131的生长发育和附着胞形成的影响。研究发现,P131在pH5.8-pH7.8菌落生长差异不是非常明显,而pH低于5.8时菌落生长开始变慢,表明酸性条件对稻瘟菌菌落生长有明显抑制作用,但稻瘟菌对酸性pH条件有一定的适应性,暗示其存在对酸性pH适应机制。在酸性pH条件下,P131产孢量明显比在碱性pH条件下更高,分生孢子梗也形成的更多,表明酸性pH有利于稻瘟菌分生孢子的形成。在酸性pH条件下,P131分生孢子萌发形成的芽管比碱性pH条件下形成的更短,且附着胞形成率更高,附着胞成熟时间更短,表明酸性pH条件有利于稻瘟菌附着胞的形成和成熟。以上分析表明,酸性pH对稻瘟菌菌丝生长,分生孢子形成和发育,以及附着胞的形成和成熟等过程具有重要意义。 为了研究参与稻瘟菌对酸性pH响应的基因,作者对实验室前期筛选出的酸性pH敏感突变体进行了分析。对9个在生长和产孢上存在缺陷的酸性pH敏感突变体进行T-DNA插入位点分析,确定了其插入破坏的候选基因,分别命名为APH1,APH2,APH3,APH4,APH5,APH6,APH7,APH8,APH9。qRT-PCR分析表明,基因APH1,APH3,APH4,APH5,APH7在分生孢子阶段表达量高于其它阶段,APH2在芽管和附着胞阶段表达量较高,APH9在成熟附着胞和初生侵染菌丝形成阶段表达量较高。然后对这些基因进行了基因敲除验证和生物学表型分析,结果表明:所有基因敲除体菌落均生长减慢,且产孢能力降低;APH1,APH2,APH3,APH4,APH5,APH7,APH9敲除体对寄主致病力减弱。不同环境压力敏感性分析发现,所有敲除体均对细胞壁抑制剂敏感,除APH5敲除体外的其它敲除体均对渗透压和活性氧敏感;APH1,APH3,APH4,APH7,APH8,APH9敲除体对酸性pH敏感,因此,确认APH1,APH3,APH4,APH7,APH8,APH9为酸性pH响应基因。 对酸性pH响应基因进行功能预测发现,钙离子信号途径,SNF1蛋白激酶信号途径,O糖基化修饰途径,细胞内吞,细胞骨架,线粒体等可能参与酸性pH响应过程。为进一步验证钙离子信号途径是否参与酸性pH响应,对该信号途径3个关键基因MoCCH1,MoMID1和MoCRZ1分别进行了基因敲除和分析。结果表明,三个基因的敲除体均对酸性pH敏感,因此初步确定稻瘟菌钙离子信号途径为参与酸性pH响应的信号途径之一。 综上所述,本研究发现酸性pH对稻瘟菌菌丝生长,分生孢子形成和附着胞形成等至关重要,鉴定出6个酸性pH响应基因,并初步明确了钙离子信号途径参与稻瘟菌酸性pH响应。以上研究为进一步深入研究稻瘟菌适应环境和寄主酸性pH的调控机制奠定了基础,为其它致病真菌的致病机理的解析提供新的思路。