论文部分内容阅读
第一部分EGFR信号通路对OGD-R处理的鼠大脑皮层星形胶质细胞活化增殖的调控作用及其机制研究目的：细胞培养观察OGD-R处理的鼠大脑皮层星形胶质细胞EGFR受体的激活与星形胶质细胞活化增殖的关系及C225是否可以抑制OGD-R诱导的星形胶质细胞的活化增殖,并对其机制进行进一步的探讨。方法：原代培养新生鼠大脑皮层星形胶质细胞,待其生长80%汇合后,用流式细胞仪技术对OGD处理2h后,随不同复氧时间(3h,6h,12h,24h)和不同浓度C225 (2μg/ml,10μg/ml)干预星形胶质细胞的细胞周期进行分析,用pEGFR和GFAP免疫荧光双标技术观察各组pEGFR的表达情况及细胞形态的变化,BrdU掺入法观察各组BrdU(+)细胞比率,并用westernblot技术对各组GFAP, pEGFR, p-ERK1/2, ki67, cyclindl, p27的表达进行分析。结果：我们发现星形胶质细胞OGD/R处理之后呈激活状态,GFAP表达增多,细胞胞体变大,突起变长,同时pEGFR的表达也明显增加。GFAP和BrdU荧光双标结果显示在复氧12h的时候,BrdU(+)细胞率比对照组增加约2倍,应用C225后改变了激活细胞的形态变化及降低了BrdU(+)细胞率。流式细胞分析发现,在复氧的3-6小时内处于S期细胞的百分比与对照组相比增高,在复氧12小时,达到高峰,随后呈降低趋势。在应用C225后,处于S期细胞的百分比在6,12,24小时与未用药组比较明显降低(P<0.01)。Western blot结果显示,C225抑制了OGD/R诱导的星形胶质细胞GFAP, cyclin D1, ki67 and p-ERK1/2的表达且上调了p27的表达。结论：C225明显抑制了OGD/R诱导的星形胶质细胞p-EGFR的表达上调和细胞周期的进程,抑制了OGD-R诱导的星形胶质细胞的活化增殖。第二部分抑制EGFR信号通路对大鼠MCAO损伤后反应性星形胶质增生的调控作用及其机制研究目的：通过大鼠体内实验进一步探明表皮生长因子信号通路是否参与中枢神经损伤后星形胶质细胞的活化增殖,并观察C225是否可抑制缺血再灌注损伤后灶周胶质瘢痕的形成,并对其机制进行探讨。方法：线栓法建立大鼠大脑中动脉梗塞(MCAO)损伤模型,在缺血后1小时拔出线栓再灌注；C225给药组用ALZET给药泵通过侧脑室注射的方法维持持续给药；在缺血再灌注后第3天,7天,14天断头取脑,应用免疫荧光标记技术,采用GFAP分别与p-EGFR、ki67和cyclinDl的双标来分析各实验组灶周星形胶质细胞EGFR信号通路的激活和灶周星形胶质细胞的活化增殖情况,并应用western blot技术对各实验组损伤灶周组织GFAP、p-EGFR、ki67、cyclinD1、p27和p-ERK1/2的表达情况进行分析。结果：免疫荧光结果显示在假手术组动物大脑GFAP有少数弱荧光表达,而在MCAO手术组动物,在手术后3天,损伤灶周GFAP即呈较强荧光表达,星形胶质细胞的胞体肥大,突起变粗,变长,且荧光双标显示这些变化与pEGFR的强荧光表达伴随发生,这种现象持续至手术后14天。在各相同时间点,C225用药组与假手术组比较,损伤灶周pEGFR和GFAP的表达明显减弱,Western blot检测结果也显示了相同的变化。GFAP/ki67, GFAP/Cyclin D1免疫荧光双标显示在术后假手术组Cyclin D1(+)和Ki-67(+)星形胶质细胞与对照组比有明显增多,而C225用药组Cyclin D1(+)和Ki-67(+)的星形胶质细胞较假手术组明显减少。Western blot分析显示在假手术组的梗死灶周组织GFAP, Ki67, cyclin D1和p-ERK1/2表达较对照组明显上调,p27表达下调,而C225的应用逆转了这种变化。结论：C225明显抑制了大鼠缺血再灌注损伤灶周星形胶质细胞p-EGFR的表达,及损伤灶周星形胶质细胞的增殖,从而抑制了胶质瘢痕的形成。第三部分抑制EGFR信号通路对大鼠MCAO损伤的神经保护作用研究目的：体内实验观察抑制EGFR信号通路是否对大鼠缺血再灌注损伤有保护作用方法：线栓法建立大鼠大脑中动脉梗塞(MCAO)损伤模型,在缺血后1小时拔出线栓再灌注；；C225给药组用ALZET给药泵通过侧脑室注射的方法维持给药；在缺血再灌注后第3天,7天,14天评估大鼠的行为学评分,并应用TTC染色法和原位末端转移酶标记(TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling, TUNEL)方法分别检测各组在MCAO缺血再灌注后梗死体积的大小和神经元凋亡的情况。结果：在假手术组,TUNEL(+)神经元很少或没有,而在缺血再灌注3天,梗塞灶区TUNEL(+)神经元明显增多,应用C225明显的减少了缺血再灌注3天TUNEL(+)神经元。应用TTC染色测量梗塞体积大小,结果发现C225用药组动物梗塞体积明显小于未用药MCAO组(200.3±21.8versus 277.3±24.1 mm3 of vehicle treated group)。在手术后第3天,7天,14天,对各组大鼠的神经功能进行评分。C225用药组较未用药MCAO组神经功能有明显改善(P<0.05, compared to the vehicle treated group)。结论：C225抑制EGFR信号通路对大鼠缺血再灌注损伤有神经保护作用。