论文部分内容阅读
目的 观察TrkA基因抑制神经母细胞瘤(NB)细胞增殖、诱导其分化及引起该细胞合成、分泌血管内皮生长因子(VEGF)下降情况；探讨TrkA基因通过抑制NB血管生成而阻止其生长、转移的可能性。 方法 1．将人NB SH-SY5Y(SY5Y)细胞复苏后常规培养，待细胞长至一定数目，将其分为三组：实验组，空载体组，对照组。2．利用脂质体转染法将pBPSTR1-TrkAcDNA重组质粒及pBPSTR1载体质粒分别转染入实验组和空载体组两组SY5Y细胞中。经0.5μg／ml嘌呤霉素筛选培养后的转化细胞系分别命名为SY5Y-TrkA及SY5Y-Vec细胞。3．分别提取两种转化细胞系及SY5Y母系细胞的总RNA，应用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术进行TrkA基因片断的扩增。扩增片断长度523bp，内参照β-actin扩增片断长度700bp。4．三组细胞以相同条件、相同密度接种在24孔板及100毫升培养瓶中，一周后利用台盼兰拒染实验判断活细胞数，并且在相差显微镜下计数分化细胞，比较转染前后细胞的增殖速度及分化程度。5．利用RT-PCR技术检测三组细胞中VEGFmRNA的表达，扩增片断长度535bp，内参照β-actin扩增片断长度422bp。所有的RT-PCR产物皆用2％的琼脂糖凝胶电泳分析。6．免疫组化检测VEGF蛋白的表达：取三组细胞制成细胞悬液，浓度为1×10°／ml。将细胞悬液均匀滴到载玻片上，戊二醛固定后进行免疫组化染色。细胞浆被染成棕黄色则视为染色阳性，实验结果以染色强度和阳性细胞百分率的得分之和进行评估。7．细胞培养上清中VEGF含量的测定：三组细胞同一条件下无血清培养液培养24小时，收获培养上清；离心后将上清液进行ELISA试验检测VEGF含量。8．瘤细胞在裸鼠皮下致瘤：三组裸鼠分别注射三组细胞悬液，浓度为(2.5×10~7个／ml／只)。接种后观察肿瘤生长情况，50天后，处死动物，取肿瘤标本 进行检测比较。9．RT－PCR检测肿瘤标本中VEGFmRNA表达；免疫组化 检测VECF蛋白表达。ic．肿瘤标本的MVD测定：苏木素伊红（HE）染色 石腊切片，数字图像分析系统计算每组血管面积。＊．数据处理：实验结果 以均数上标准差（X i SD）表示，两均数比较采用 t检验。 结 果 1．成功转染TrkA基因并在SYSY细胞中稳定表达，转染后SYSY细胞 的增殖率较亲代细胞明显下降h＜0．00入细胞的分化程度增加h＜0． 001）。2．SYSY－TrkA细胞中的 VEGF mRNA（P＜0．of）及蛋白表达（P＜ 0．co间较亲代S％Y细胞明显下降；细胞培养上清液中的VEGF含量也明 显下降h＜0．00人3．SYSY－TrkA细胞在裸鼠皮下的致瘤性和其所致 肿瘤的血管生成能力明显下降。实验组与对照组及空载体组相比，肿瘤体 积缩小（p＜0．01）；VEGF的表达差别显著（p＜0．of）；MVD差别显著（p＜ 0．of）。 结 论 1．TrkA基因的高表达能有效抑制神经母细胞瘤的生长，并能促其分 化成熟；Ts的信号通路在NB的生长分化中起着重要的作用。 LTs基因的高表达能有效抑制NB细胞合成分泌血管内皮生长因 子。 3．TrkA基因能降低NB细胞的致瘤性及抑制神经母细胞瘤的血管生 成和肿瘤生长。为应用该基因行抗血管治疗神经母细胞瘤触理论依据。