论文部分内容阅读
目的检测miRNA-34c-5p在胃癌组织和胃癌细胞中的表达;探究硫酸右旋糖苷(DS)是否通过调控miRNA-34c-5p抑制人胃癌细胞增殖、侵袭和迁移。方法1.通过课题组前期测序结果与miRCancer数据库取交集,共获得5个miRNAs,通过RT-q PCR检测5个miRNAs在胃癌组织和癌旁正常组织中的表达情况,从中选取表达差异最大的miRNA-34c-5p作为本实验研究对象。2.采用RT-q PCR检测30例胃癌组织和胃癌细胞系(AGS、HGC-27、MKN-28、MKN-45)中miRNA-34c-5p m RNA的表达水平。3.体外培养胃癌HGC-27细胞株和MKN-28细胞株,分别转染miRNA-34c-5p-mimics和miRNA-34c-5p-inhibitor,通过倒置荧光显微镜观察转染情况,RT-q PCR检测转染效率,CCK-8、克隆形成、wound healing及Transwell实验检测过表达miRNA-34c-5p和miRNA-34c-5p沉默后对人胃癌细胞增殖、侵袭迁移的影响,western blot检测增殖、侵袭迁移相关因子的表达。4.使用DS干预4株胃癌细胞24h,采用RT-qPCR检测miRNA-34c-5p的表达变化;将miRNA-34c-5p-mimics和miRNA-34c-5p-inhibitor分别转入HGC-27和MKN-28细胞,通过CCK-8、克隆形成、wound healing及Transwell实验检测过表达或沉默miRNA-34c-5p的胃癌细胞经DS干预后,对细胞增殖、侵袭迁移能力的影响,并用western blot、细胞免疫荧光染色实验检测增殖、侵袭迁移相关因子的表达情况。5.体内实验构建裸鼠腹腔转移瘤模型,分为对照组和DS组,经DS干预14天后,采用RT-q PCR检测miRNA-34c-5p的表达,western blot检测增殖、侵袭迁移相关因子的表达。结果1.根据测序结果与数据库取交集后,得到以下5个miRNAs:miRNA-34c-5p、miRNA-133b、miRNA-155-5p、miRNA-204-5p、miRNA-122-5p;且5个miRNAs在胃癌组织中均呈低表达,从中选取表达差异最大的miRNA-34c-5p作为研究对象。2.miRNA-34c-5p在30例人胃癌组织中的表达明显低于癌旁正常组织(P<0.01);同时miRNA-34c-5p在4株人胃癌细胞中的表达明显低于正常胃粘膜上皮细胞(P<0.05,P<0.01);其中HGC-27细胞中miRNA-34c-5p表达量最低,MKN-28细胞中的表达量最高,因此选取HGC-27细胞转染miRNA-34c-5p-mimics,MKN-28细胞转染miRNA-34c-5p-inhibitor进行后续实验。3.倒置荧光显微镜显示:HGC-27和MKN-28各转染miRNA-34c-5p-mimics、miRNA-34c-5p-inhibitor后,GFP荧光转染效率>90%,RT-q PCR结果显示:相较于mimics-NC,miRNA-34c-5p-mimics组的miRNA-34c-5p相对表达水平明显升高(P<0.05),相反的,对比inhibitor-NC组,miRNA-34c-5p-inhibitor组的miRNA-34c-5p相对表达水平明显降低(P<0.01)。miRNA-34c-5p过表达可明显抑制人胃癌细胞增殖、侵袭迁移,反之则促进人胃癌细胞增殖、侵袭迁移。miRNA-34c-5p过表达可上调E-cad表达、下调N-cad、MMP2、Vimentin、PCNA表达;沉默miRNA-34c-5p可下调E-cad表达、上调N-cad、MMP2、Vimentin、PCNA表达(P<0.01)。4.DS干预后,可以明显增强胃癌细胞中miRNA-34c-5p的表达(P<0.05,P<0.01);DS可以明显增强miRNA-34c-5p过表达对人胃癌细胞增殖、侵袭迁移的抑制作用;DS也可逆转miRNA-34c-5p沉默对人胃癌细胞增殖、侵袭迁移的促进作用。Western blot与细胞免疫荧光染色实验的结果显示:DS干预miRNA-34c-5p-mimics后,可增加E-cad表达、减少N-cad、MMP2、Vimentin、PCNA表达;DS干预miRNA-34c-5p-inhibitor后,则作用相反(P<0.05)。5.体内实验表明:DS可以升高miRNA-34c-5p在裸鼠腹腔大网膜及肝脏转移瘤中相对表达(P<0.05,P<0.01),并且可以使E-cad表达增加,Vimentin、PCNA表达降低(P<0.01)。结论1.miRNA-34c-5p在人胃癌组织和胃癌细胞中低表达。2.miRNA-34c-5p过表达可以抑制人胃癌细胞增殖、侵袭和迁移,miRNA-34c-5p低表达可以促进人胃癌细胞增殖、侵袭和迁移。3.DS通过调控miRNA-34c-5p的表达抑制人胃癌细胞增殖、侵袭和迁移。