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研究背景和意义载脂蛋白L1是人体内的固有免疫因子,仅在人类和少数哺乳动物体内表达。作为该蛋白家族中唯一可以分泌到血液中的成员,APOLl蛋白是高密度脂蛋白的组成成分,具有溶锥虫作用。2014年,Taylor等阐明细胞内APOL1蛋白具有抗感染作用。细胞内APOLl蛋白可以抑制HIV-1在巨噬细胞内的复制。本课题组前期研究发现,在EV-A71感染引起的手足口病重症患儿血液中APOLl蛋白过高表达。因此本研究通过构建Apol1基因敲除细胞株和过表达细胞株来探究APOLl蛋白对EV-A71在细胞内复制中的作用,不仅有助于理解EV-A71的致病机制,而且可以为EV-A71的重症感染的防治提供新的思路和途径。研究方法(1)针对Apol1基因设计siRNA,敲减HBMEC细胞中APOL1蛋白表达并检测细胞中EV-A71的复制情况。(2)利用CRISPR/Cas9技术构建敲除Apol 1基因的HBMEC稳定细胞株(3)利用Cumate表达载体构建可诱导稳定表达APOLl的293T细胞株(4)EV-A71分别感染以上构建的两种细胞株,探索APOL1与EV-A71复制的关系结果(1)在HBMEC中,转染Apol1 siRNA并感染EV-A71 24h后,细胞内病毒含量相对于未敲减的细胞显著提高(F=170.4,p<0.05)(2)成功构建敲除Apol1的HBMEC细胞,命名为HBMEC-APOL1-KO,同时感染空载病毒的细胞命名为HBMEC-Lenti。(3)成功构建可诱导表达APOLl蛋白的293T细胞,命名为293T-APOLl-GFP,同时感染空载的细胞命名为293T-GFP。经rea1-time PCR和western blot验证,293T-APOL1-GFP细胞表达APOL1的量随着诱导剂浓度的增加而增加,且到50μg/ml和100μg/ml时,APOL1蛋白表达量达到最大(F=537.9,p<0.01)。CCK-8实验证明诱导剂浓度低于200μg/ml时,细胞生长无影响(F=1.082,p=0.2903)。(4)病毒分别感染HBMEC-APOL1-KO和293T-APOL1-GFP细胞株,出现同样的结果,病毒感染12h,细胞内病毒含量比对照组明显提高(F=196.2,p<0.001;F=561.5,p<0.001)。结论在正常情况下,HBMEC细胞内高表达的APOL1可抑制EV-A71的复制;在无APOL1表达HBMEC中,EV-A71的复制增加;在过表达APOL1的293T中,EV-A71的复制也增加。综上所述,本研究初步确定了在EV-A71的复制过程中,APOL1发挥了一定的作用