细胞重编程(Cell reprogramming)是指在一定条件下体细胞的记忆被清除,重新程序化产生新的表型和功能,从而导致细胞命运发生改变,主要发生在不涉及基因组DNA序列改变的基因表达水平,即通过改变细胞基因表达程序的时空差异,对其进行重新编程而改变细胞的分化方向,获得新的细胞类型。近年来,世界各地的研究者对细胞重编程技术充满了浓厚的兴趣,也使得细胞重编程技术得以长足发展。自2006年日本京都大学学者Yamanaka通过四个重编程因子(Oct4,SOX2,Klf4和c-Myc)把小鼠成纤维细胞诱导为诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS cells),在此之后,更是掀起一股细胞重编程研究的热潮。在2012年,也就是iPS细胞的首篇论文发表6年后,Yamanaka和细胞重编程的先驱英国学者Gurdon一同获得了2012年度诺贝尔生理学或医学奖。这无疑也是对细胞重编程发展的褒奖与肯定。直接重编程的另一种说法是谱系重编程(lineage reprogramming),既直接将成体细胞转分化为其他类型的功能细胞或祖细胞。从本质来讲,iPS细胞诱导与谱系重编程同属于细胞重编程范畴,细胞基因组并没发生改变,只是表观遗传信息以及基因表达的时空顺序发生了改变所致；从具体来讲,把终末分化的成体细胞或成体干细胞诱导为iPS细胞是一种去分化(de-differentiation)的过程,而谱系重编程涉及的是转分化(trans-differentiation)的过程。从再生医学以及各种应用前景来讲,由于iPS细胞具有胚胎干细胞的特性,所以最终的应用还需分化为各种不同类型的细胞；而谱系重编程能直接把一种细胞转换为另一种终末分化的细胞。据最近研究报道,利用谱系重编程技术已经成功把成纤维细胞转换为p-细胞、骨骼肌细胞、神经元细胞、心肌细胞和肝细胞等细胞类型,这些充分展现谱系重编程简便、快捷、高效率的优势。c-Myc蛋白属于Myc家族的转录因子,其中还包括N-Myc和L-Myc基因。研究表明,c-Myc基因所调控的基因几乎占了所有基因的15%,通过修改其靶基因的表达,c-Myc蛋白在调控正常细胞增殖、生长、分化、凋亡、存活以及干细胞自我更新以及多潜能性的建立和维持等方面扮演着重要的角色。在Yamanaka首先利用四个重编程因子(Oct4, Sox2, Klf4和c-Myc)诱导小鼠成纤维细胞为iPS细胞时,其中c-Myc扮演着重要角色,在后续将人成纤维细胞、胰腺beta细胞和B淋巴细胞等多种体细胞重编程为iPS细胞的过程中,c-Myc也参与其中；而当撤除c-Myc,其余三个重编程因子(Oct4, Sox2和Klf4)亦能将体细胞重编程为iPS细胞,但此时重编程效率低下甚至不能有效重编程时有发生。因此, c-Myc也成为经典的“Yamanaka四因子”之一,在细胞重编程过程中发挥举足经重的作用。有鉴于此,我们也试图利用c-Myc基因开展重编程研究工作,通过慢病毒介导的投递系统把c-Myc基因导入猪胚胎成纤维细胞中,在很短的时间内我们惊奇的观察到细胞形态发生极大地改变,然而,我们不能判断细胞发生了何种转变?是否转化成了一种新的细胞类型?这个新转化的细胞究竟是什么细胞?为明确细胞类型,我们将形态发生改变的细胞接种至裸鼠皮下,大约4周左右可见肿块形成,剥离肿块组织行病理分析,观察到了大量的软骨组织存在。查阅文献发现,c-Myc与骨的发育密切相关；2011年日本学者Kunihiko Hiramatsu报道应用c-Myc、Klf4和Sox9三个因子成功将小鼠成纤维细胞直接重编程为软骨细胞,该研究再次证实了c-Myc基因在重编程的重要作用,同时也间接支持了我们的预实验结果。Kunihiko Hiramatsu报道中需要三个因子才能实现成纤维细胞重编程为软骨样细胞,实际应用中这显然增加了操作的难度,依据此方法为组织工程提供种子细胞亦不胜理想；而我们的预实验结果(即新生肿物软骨组织)提示,单个基因c-Myc即有可能将成纤维细胞直接诱导为软骨样细胞,如果真如此,这无疑是巨大的进步。软骨组织有着特殊的生物学特征。软骨组织(cartilage tissue)由软骨细胞和软骨基质构成；软骨组织及周围的软骨膜构成软骨。软骨是胚胎早期的主要支架成分,随着胎儿发育逐渐被骨所取代。在成体内,仅散在分布,但起着重要作用,如关节软骨具有支撑重量和减少摩擦的作用,呼吸道软骨具有支架作用。软骨结构简单,组成单一,仅由一种细胞-软骨细胞构成,无血管与神经等结构；但是,正因为软骨结构上的这种特点限制了软骨损伤后的修复。临床上病人软骨缺损后几乎不能自身修复,同时又缺乏合适的软骨移植供体,造成了外科治疗中的一大难题。因此,软骨组织如果能构建成功,不但具有重要的理论创新意义,还具有重大的临床应用价值。软骨组织工程经历了几个阶段的长足发展,人们越来越意识到,种子细胞将是限制软骨组织走向临床的主要障碍之一,研究人员通过各种研究手段获取种子细胞,比如胚胎干细胞、间充质干细胞、同种异体软骨细胞等,但不可避免的存在分离纯化困难,效率低下,免疫排斥等不利影响。因此,寻找一种可以快速而便捷的获取软骨种子细胞的方法无疑会促进软骨组织工程的发展,从而实现大规模软骨组织的临床应用。有鉴于此,我们将c-Myc在将成纤维细胞重编程为软骨样细胞过程中的作用及机制作为本课题研究的重点。本课题将从以下几个方面开展研究：(1)明确单个c-Myc能否将猪成纤维细胞重编程为软骨样细胞；(2)明确c-Myc是否也能将小鼠和人的成纤维细胞重编程为软骨样细胞；(3)探讨c-Myc直接重编程成纤维细胞为软骨样细胞的分子机制。研究结果如下：1.建立稳定过表达c-Myc转基因的猪胚胎和皮肤成纤维细胞1.1成功制备猪胚胎成纤维细胞(PEFs)和皮肤成纤维细胞(PDFs)分别以35天孕龄的母猪和出生1-3天的新生西藏小型猪制备PEFs和PDFs,细胞呈长梭形,多角形和扁平星形的典型成纤维细胞形态,细胞连续传8代仍然增殖活跃,生长状态良好,我们选取P2代的细胞作为实验细胞。1.2c-Myc慢病毒质粒的鉴定1.2.1酶切鉴定质粒经转化成功后,挑取克隆摇菌,小提后经限制性内切酶(BamH Ⅰ/KpnI和EcoR Ⅰ/EcoR V)双酶切,结果显示酶切片段与预期片段相符1.2.2测序鉴定提供经酶切鉴定的质粒pLenti-EF1α-c-Myc-IRES-EGFP送测序,测序结果与GeneBank数据库进行Blast比对,发现测序结果与预期序列一致。1.3利用慢病毒载体pLenti-EF1α-c-Myc-IRES-EGFP生产慢病毒及其滴度测定慢病毒生产：pLenti-EF1α-c-Myc-IRES-EGFP或pLenti-EF1α-IRES-EGFP和psPAX2及pMD2.G共转染293T细胞,包装产生两种慢病毒,即携带空载的慢病毒(LV-con)和携带c-Myc的慢病毒(LV-c-Myc);转染后24h,荧光显微镜下可见293T细胞发出绿色荧光。病毒滴度测定：空白对照慢病毒(LV-con)的病毒滴度为9.2×106TU/ml,携带c-Myc的慢病毒(LV-c-Myc)滴度为6.2×106TU/ml。1.4稳定过表达c-Myc转基因的猪胚胎和皮肤成纤维细胞的的建立将慢病毒LV-c-Myc和LV-con分别感染PEFs和PDFs,感染48h后荧光显微镜下可见绿色荧光。1.4.1c-Myc转基因表达检测Western blot和免疫荧光检测显示,c-Myc转基因在携带c-Myc转基因的PEFs和PDFs能够正常表达。稳定过表达c-Myc转基因的PEFs和PDFs分别命名为PEF-c-Myc和PDF-c-Myc,携带空载的细胞分别为各自的LV-con细胞。2. c-Myc将猪胚胎成纤维细胞重编程为软骨样细胞2.1成功制备西藏小型猪软骨细胞以新出生1-3天的西藏小型猪制备原代软骨细胞,细胞呈梭形,多角形特征；对制备的细胞做甲苯胺蓝染色和阿利新蓝染色,结果呈阳性,而对照细胞PEFs未能染上；细胞免疫荧光结果显示,猪原代软骨细胞Type Ⅱ collagen和Aggrecan呈阳性反应,而Type Ⅰ collagen呈阴性结果,PEFs Type Ⅰ collagen呈呈阳性反应。上述结果证实,成功制备西藏小型猪软骨细胞。2.2CCK-8检测PEF-c-Myc(简称P-C细胞)增殖能力采用析因设计资料的方差分析分析时间与细胞的交互作用,结果表明细胞种类与不同天数间存在交互效应(F=66.318,P<0.001)；细胞OD值在两组间差异具有统计学意义(F=237.587,P<0.001),在不同天数差异具有统计学意义(F=857.48,P<0.001)；两组细胞的OD值,在第三天差异具有统计学意义(t=3.500,P=0.046),并从第五天开始随时间增加差异越发显著(t值分别为：6.388,6.309,35.816,P值均小于0.05)。结果表明：P-C细胞在体外比LV-con细胞以及原代软骨细胞(Pr Ch)具有更强的增殖能力。2.3过表达c-Myc转基因的P-C细胞形态变化慢病毒LV-c-Myc感染PEFs4天左右,细胞形态发生明显改变,由长梭形变成短梭、椭圆以及多角形,这与猪软骨原代细胞的形态十分相似,同时,该细胞经胰酶消化连续传代仍能保持这种细胞形态,而在感染LV-con的PEFs上没有观察到如上细胞形态变化。2.4甲苯胺蓝和阿利新染色鉴定P-C细胞是否具有软骨细胞的特性软骨细胞具有分泌酸性糖胺多糖的特性,故通常采用甲苯胺蓝染色和阿利新染色检测酸性糖胺多糖,以鉴别细胞是否具有软骨细胞的特性。为此,我们拟借助该特异染色方法鉴别P-C细胞是否也具有分泌酸性糖胺多糖的特性,以初步判断P-C细胞是否具有软骨细胞的一些特征。染色结果显示,甲苯胺蓝染色P-C细胞呈蓝紫色,阿利新染色P-C细胞呈蓝色,而对照细胞这两种染色呈阴性。2.5荧光定量PCR检测P-C细胞上软骨相关基因的表达独立样本t检验分析结果显示：软骨相关基因Col2a1(t=5.185, P=0.035)、Acan (t=7.612, P=0.017)、Sox5(t=5.023, P=0.037)和Sox6(t=10.980,P=0.008)在P-C细胞上表达上调(表2-2,图2-4A),而间充质相关基因Collal(t=-263.982,<0.001)和Colla2(t=-163.504, p<0.001)在P-C细胞上表达下调,差异具有统计学意义。2.6细胞免疫荧光检测P-C细胞上软骨相关基因表达以LV-con空载细胞为阴性对照,Pr Ch细胞为阳性对照,细胞免疫荧光检测结果显示,P-C细胞Type Ⅱ collagen和Aggrecan染色呈阳性反应,而Type Ⅰ collagen染色呈阴性结果,该结果与qRT-PCR结果一致。2.7P-C细胞染色体核型分析收集对数生长的P-C细胞送至南方医院产前诊断中心做染色体核型分析,结果显示,19对染色体,未见缺失、畸变和异位等染色体异常改变。2.8P-C细胞移植至裸鼠皮下,并鉴别所形成肿块的组织类型在裸鼠皮下接种P-C细胞,4周左右可见接种部位新生肿块,质地硬,而移植LV-con空载细胞处未见肿块出现。接下来我们处死一只裸鼠,肿块剥离下来后发现其含有大量白色软骨样组织,取部分组织固定并石蜡包埋和切片,HE染色结果展示了大量的软骨细胞,接着对组织行甲苯胺蓝染色和免疫组化染色(检测EGFP表达)以进一步鉴别组织类型和来源,染色结果显示,甲苯胺蓝染色呈阳性,其中胞核呈蓝色,基质部分呈蓝紫色,EGFP免疫组化可见棕黄色颗粒。3. c-My将猪皮肤成纤维细胞重编程为软骨样细胞3.1过表达c-Myc转基因的PDFs-c-Myc(简称D-C细胞)细胞形态变化慢病毒LV-c-Myc感染PDFs4天左右,细胞形态发生明显改变,由长梭形变成短梭、椭圆以及多角形,这与猪软骨原代细胞的形态十分相似,同时,该细胞经胰酶消化连续传代仍能保持这种细胞形态,而在感染LV-con的PEFs上没有观察到如上细胞形态变化。3.2CCK-8检测D-C细胞增殖能力采用析因设计资料的方差分析分析时间与细胞的交互作用,结果表明细胞种类与不同天数间存在交互效应(F=47.631,P<0.001)；细胞OD值在两组间差异具有统计学意义(F=239.485,P<0.001)；在不同天数差异具有统计学意义(F=853.195,P<0.001)；两组细胞的OD值,自第五天差异具有统计学意义(t=6.388.P=0.003),并随时间增加差异越发显著(t值分别13.563,17.714,P小于0.001)。结果表明：D-C细胞在体外比LV-con细胞以及原代软骨细胞(Pr Ch)具有更强的增殖能力。3.3甲苯胺蓝和阿利新染色鉴定D-C细胞是否具有软骨细胞的特性软骨细胞具有分泌酸性糖胺多糖的特性,故通常采用甲苯胺蓝染色和阿利新染色检测酸性糖胺多糖,以鉴别细胞是否具有软骨细胞的特性。为此,我们拟借助该特异染色方法鉴别D-C细胞是否也具有分泌酸性糖胺多糖的特性,以初步判断D-C细胞是否具有软骨细胞的一些特征。染色结果显示,甲苯胺蓝染色D-C细胞呈蓝紫色,阿利新染色D-C细胞呈蓝色,而对照细胞这两种染色呈阴性。3.4细胞免疫荧光检测D-C细胞上软骨相关基因表达以LV-con空载细胞为阴性对照,Pr Ch细胞为阳性对照,细胞免疫荧光检测结果显示,D-C细胞Type Ⅱ collagen和Aggrecan染色呈阳性反应,而Type I collagen染色呈阴性结果。4. c-Myc将小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)和人皮肤成纤维细胞(HDFs)重编程为软骨样细胞4.1过表达c-Myc转基因的MEFs-c-Myc(简称M-C细胞)和HDFs-c-Myc(简称H-C细胞)细胞形态变化慢病毒LV-c-Myc感染MEFs和HDFs4天左右,两种细胞形态发生明显改变,由长梭形变成短梭、椭圆以及多角形,这与软骨原代细胞的形态十分相似,同时,该细胞经胰酶消化连续传代仍能保持这种细胞形态,而在感染慢病毒LV-con的MEFs和HDFs上没有观察到如上细胞形态变化。4.2甲苯胺蓝和阿利新染色鉴定M-C和H-C细胞是否具有软骨细胞的特性我们拟借助该软骨特异染色方法鉴别M-C和H-C细胞是否具有分泌酸性糖胺多糖的特性,以初步判断M-C和H-C细胞是否具有软骨细胞的一些特征。染色结果显示,甲苯胺蓝染色M-C和H-C细胞呈蓝紫色,阿利新染色M-C和H-C细胞呈蓝色,而对照细胞这两种染色均呈阴性。4.3细胞免疫荧光检测M-C和H-C细胞上软骨相关基因表达以LV-con空载细胞为阴性对照,Pr Ch细胞为阳性对照,细胞免疫荧光检测结果显示,M-C和H-C细胞Type Ⅱ collagen和Aggrecan染色呈阳性反应,而Type Ⅰ collagen染色呈阴性结果。5. c-Myc重编程成纤维细胞为软骨样细胞分子机制的初步探讨5.1c-Myc过表达在PEFs和PDFs上诱导了上皮样形态变化慢病毒LV-c-Myc感染PEFs和PDFs4天左右,P-C和D-C细胞形态发生明显改变,由长梭形变成短梭、椭圆以及多角形,呈上皮样改变,而在对照细胞上未观察到类似的细胞形态改变。5.2c-Myc过表达在PEFs和PDFs上诱发问充质-上皮转换(MET)相关基因表达变化qRT-PCR检测结果显示：病毒感染后第五天,P-C中上皮相关基因E-cadherin、Occludin、Krt8、Krt18和Bves(t值分别为：30.249,42.920,8.155,66.509,335,476,P值均小于0.05)表达明显上调,差异具有统计学意义,而间充质相关基因Vimentin、Fn、MMP12、MMP14、Col1a1和Col5a2(t值分别为：-23.342,-123.115,-0.0001,-147.466,-9.390,-31.667,P值均小于0.05)表达下调,差异具有统计学意义；病毒感染后第十天,P-C中上皮相关基因E-cadherin、Occludin、Krt8、Krt18和Bves(t值分别为：3.593,33.964,12.337,9.688,31.960,除E-cadherin P=0.069外,其余P值均小于0.05)表达显著上调,差异具有统计学意义,而间充质相关基因Vimentin、Fn、MMP12、 MMP14、Col1a1和Col5a2(t值分别为：-31.486,-330.556,-0.0001,-0.0002,-231.595,-65.426,P值均小于0.05)表达显著下调,差异具有统计学意义。细胞免疫荧光检测结果显示：上皮相关蛋白E-cadherin和a-catenin在P-C和D-C细胞中染色呈阳性反应,结果与qRT-PCR检测结果一致,而对照细胞E-cadherin和α-catenin无表达。Western blot检测结果显示：在P-C细胞中,间充质相关蛋白vimentin表达显著下调,上皮相关蛋白(如Krt18、α-catenin和Bves)表达显著上调；在D-C细胞上,间充质相关蛋白vimentin表达同样下调,而上皮相关蛋白(即a-catenin和Bves)表达显著上调。5.3采用Transwell assa解价过表达c-Myc基因的P-C和D-C细胞迁移能力Transwell assay结果显示,与LV-con对照细胞相比,P-C细胞和D-C细胞穿过膜的细胞数显著减少,这提示P-C细胞和D-C细胞迁移运动能力较对照的显著降低。5.4过表达c-Myc转基因的P-C和D-C细胞贴附能力评价当细胞发生间充质-上皮转变(mesenchymal-epithelial transition, MET)时,通常细胞粘附能力增强,此时E-cadherin表达上调,同时细胞运动能力减弱。在本研究中,过表达c-Myc转基因的P-C和D-C细胞的贴附能力明显增强。5.5激光扫描共聚焦显微镜观察P-C和D-C细胞F-actin应力纤维网P-C和D-C细胞以及相应对照细胞经phalloidin染色(红色),激光扫描共聚焦显微镜观察显示,P-C和D-C细胞的F-actin应力纤维网遭到破坏,仅少量剩余,而对照细胞的F-actin应力纤维网大量存在,清晰可见。5.6P-C和D-C细胞电镜观察微丝结构经特殊处理的的细胞置于扫描电镜下观察发现,相对对照细胞,P-C和D-C细胞的丝状伪足(filopodia)和片状伪足(lamellipodia)显著减少,而对照组细胞仍有大量丝状伪足和片状伪足存在。5.7P-C细胞中Rho-GTPase活性检测Western blot检测结果显示,P-C细胞上活性形式的RhoA、RhoC和Rac1水平较对照组细胞的明显降低；而活性形式的cdc42在P-C细胞上未能检测到,对照组细胞则能检测到活性形式的cdc42。结论：(1)过表达c-Myc基因能直接将猪皮肤和胚胎成纤维细胞高效率重编程为软骨样细胞,并且将过表达c-Myc转基因的猪胚胎成纤维细胞移植至裸鼠皮下能形成软骨组织；(2)过表达c-Myc基因亦能将人和小鼠成纤维细胞直接高效率诱导为软骨样细胞；(3) c-Myc过表达可在猪皮肤和胚胎成纤维细胞上诱导间充质-上皮转化(MET),同时相关间接证据提示c-Myc诱导的MET有可能在c-Myc将成纤维细胞重编程为软骨样细胞的过程中发挥重要作用,c-Myc诱导的MET亦有可能是c-Myc将成纤维细胞重编程为软骨样细胞的一个早期必经事件,这有待进一步实验加以证实。本研究创新之处：1.首次证实,单个因子(即c-Myc)即可将猪、小鼠和人的成纤维细胞高效率在体外直接重编程为软骨样细胞,且能在体内环境下形成软骨组织。2.首次发现,c-Myc过表达可在成纤维细胞上诱导MET。