【摘 要】
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乳腺癌是常见的女性恶性肿瘤之一,严重威胁广大妇女的身心健康。而我国乳腺癌发病率的增长速度是全球的两倍多,并且发病有年轻化的趋势,严重影响了年轻女性以及育龄妇女的生活和工作。随着医疗水平的不断提高,乳腺癌的治疗手段也日益丰富,治疗效果有了较大提升,但是对于晚期、转移性的乳腺癌患者,其预后非常不好。近年来,非编码RNA（noncoding RNAs,ncRNAs）在人类癌症中的研究越来越多,其重要的调
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乳腺癌是常见的女性恶性肿瘤之一,严重威胁广大妇女的身心健康。而我国乳腺癌发病率的增长速度是全球的两倍多,并且发病有年轻化的趋势,严重影响了年轻女性以及育龄妇女的生活和工作。随着医疗水平的不断提高,乳腺癌的治疗手段也日益丰富,治疗效果有了较大提升,但是对于晚期、转移性的乳腺癌患者,其预后非常不好。近年来,非编码RNA（noncoding RNAs,ncRNAs）在人类癌症中的研究越来越多,其重要的调控作用也逐渐被大家所认可。本研究利用TCGA数据库获得乳腺癌早中晚期差异表达的阶段特异性miRNA和lncRNA,并对获得的差异基因进行GO和pathway分析,再通过表达变化趋势分析、生物信息学分析和负相关分析等进一步构建非编码RNA调控网络,获得调控网络中关键非编码RNA,为乳腺癌的早期筛查、疾病进展监测以及预后提供潜在靶点。第一部分乳腺癌早中晚期特异性差异非编码RNA的筛选以及IncRNA-miRNA-mRNA调控网络的构建目的:通过运用TCGA数据库大样本数据分析,获得乳腺癌早中晚期不同时期特异性差异表达的非编码RNA,并通过构建lncRNA-miRNA-mRNA调控网络,获得调控网络中关键的非编码RNA。方法:自TCGA数据库中下载并整合数据,根据病例临床信息分组（A、正常组,B、BRCA早期组,C、BRCA中期组,D、BRCA晚期组）,并从miRNA-seq、RNA-seq检测数据中提取各组样本的相关数据。分别将早期（n=104）、中期（n=404）和晚期（n=192）BRCA与癌旁正常组织（n=84）对比,分别筛选获得早中晚期特异性差别表达的miRNA、lncRNA和mRNA。进一步通过表达变化趋势分析、生物信息学分析和负相关分析最终获得非编码RNA及其可能调控的靶基因构建lncRNA-miRNA-mRNA调控网络。对网络中处于关键位置的非编码RNA和靶基因进一步进行生存相关分析,通过瞬时转染和实时定量PCR技术验证其可能存在的调控关系。结果:通过以上分析,分别获得乳腺癌早期差异表达的miRNA 148条、lncRNA193条,乳腺癌中期差异表达的miRNA 166条、lncRNA 208条,乳腺癌晚期差异表达的miRNA 163条、lncRNA207 条;122 个 lncRNA、67 个 miRNA 和 119 个 mRNA 用于构建了lncRNA-miRNA-mRNA调控网络;结果提示miR-20b/93/106a/106b家族处于调控网络的中心;通过对 GSE57897、GSE44124、GSE58606 数据的分析确认该 miR-20b/93/106a/106b家族在乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织,与我们分析结果一致;4个关键lncRNA（MESTIT1、LOC100128164、LINC00667 和 DNMBP-AS1）和 2 个靶基因（ATP1A2和NR4A3）与总存活率呈正相关（OS,log-rank p<0.05）,并进一步通过瞬时转染和实时定量PCR技术证实了 miR-93与靶基因ATP1A2的调控关系。结论:非编码RNA在乳腺癌的早中晚期均有差异表达,随着乳腺癌的进展,在不同时期表现出一定的表达趋势。通过构建的lncRNA-miRNA-mRNA调控网络揭示了miR-20b/93/106a/106b家族可能在乳腺癌的进展中发挥着重要作用,靶向这些关键的非编码RNA可能对乳腺癌病程进展的有效控制给与提示,从而提供新的治疗选择。第二部分 调控网络中关键分子miR-93-5p的功能研究目的:miR-93在乳腺癌非编码RNA的调控网络中处于核心位置,通过转染技术过表达miR-93或敲降miR-93,检测miR-93对乳腺癌细胞生物学行为的影响。方法:利用脂质体转染的方法,在乳腺癌MCF-7细胞系中过表达miR-93或敲降miR-93后,CCK-8法检测乳腺癌细胞系MCF-7细胞的增殖情况;Transwell小室方法检测乳腺癌细胞系MCF-7细胞迁移能力和侵袭能力的变化;流式细胞术检测乳腺癌细胞系MCF-7细胞的凋亡情况。结果:miR-93可以显著地促进MCF-7细胞的增殖,而对凋亡的作用并不显著;可以显著的促进乳腺癌的侵袭,而对迁移影响并不显著。结论:miR-93可以显著地促进乳腺癌细胞株MCF-7细胞的增殖和侵袭生物学恶性行为,进而参与调控乳腺癌的病程进展。
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