论文部分内容阅读
研究背景和目的:颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy,TLE)是难治性癫痫的常见类型。目前认为颞叶癫痫难治的重要原因是神经环路重建以及兴奋性异常的神经网络形成,但其机制欠清楚。因此,探索神经网络兴奋性异常的原因具有重要意义。业已证实,癫痫发病与兴奋性谷氨酸能突触传递效能增高密切相关,其机制涉及突触前神经递质的释放增加、突触间隙谷氨酸盐代谢障碍、突触后受体的敏感性增加3个方面。以往的研究多侧重于突触前和突触间隙调节机制,而对突触后调节机制研究不多。突触后致密物(postsynaptic density,PSD)作为兴奋性突触后膜的超级信号复合体,可调节突触后受体的敏感性,改变神经信号传递的下游效应,势必最终决定兴奋性突触的传递效能,这可能是癫痫神经网络兴奋性异常形成的核心所在,亟待深入探讨。但PSD与癫痫的关系国内外研究甚少,只见于数量有限的几种PSD蛋白质表达变化,迫需全面深入探讨PSD蛋白与TLE发病的关系。为更快、更深入、更全面地探讨PSD蛋白质在颞叶癫痫形成中的作用机制,本研究采用高通量、高敏感的蛋白质组学技术,构建颞叶癫痫大鼠全脑组织PSD蛋白质的双向凝胶电泳图谱,首次对颞叶癫痫相关PSD蛋白进行筛选和鉴定,为深入研究PSD蛋白与癫痫的关系提供线索,为寻找TLE防治新靶点提供依据。研究方法:建立氯化锂—匹罗卡品大鼠颞叶癫痫模型。实验分为三组,即TLE自发组(spontaneous recurrent seizure,SRS)、TLE无自发组(non-spontaneous recurrent seizure,NSRS)、正常对照组(Norm组)。采用蔗糖密度梯度离心联合膜顺序提取法分别提取三组大鼠全脑组织的PSD蛋白成分。利用蛋白质组学技术对提取的PSD蛋白进行比较筛选,鉴定出TLE发作相关蛋白,并采用western免疫印迹法进一步验证部分TLE相关PSD蛋白的表达情况。研究结果:1、氯化锂—匹罗卡品大鼠颞叶癫痫模型:致痫成功率为91.4%,模型成功率为71.4%,死亡率为20%。2、PSD纯度的检验:检测发现突触后标志分子NR1和PSD-95在P2成分、突触体和PSD蛋白三组成分中均呈免疫印迹阳性,而突触前标志分子SynPhy在PSD成分中呈阴性。3、PSD蛋白质的双向凝胶电泳:通过PDQuest软件进行比较分析,结果显示:One-PSD图谱约有286±25个蛋白质点,Two-PSD图谱有720±17个蛋白质点,两组比较有显著差异性(P＜0.01)。与对照组相比较,TLE自发组(SRS)表达上调的有12个,表达下调的有58个;TLE无自发组(NSRS)表达上调的有15个,表达下调的有38个。与TLE无自发组比较,TLE自发组表达上调的蛋白点有15个,表达下调的有25个。其中发现仅在TLE自发组特异表达的有4个。4、部分差异PSD蛋白点的质谱分析:鉴定的26个差异蛋白质点根据功能可分为6类:①细胞骨架蛋白:微管蛋白tubulin alpha和tubulin beta,internexin-alpha,actin;②运输蛋白:Sorting Nexin 3(SNX3);③能量代谢相关酶蛋白:肌酸激酶(creatine kinase,CK),果糖二磷酸醛缩酶(fructose-bisphosphate aldolase A,FBA),甘油醛三磷酸脱氢酶(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH),琥珀酸辅酶A连接酶(Succinate-coenzyme A ligase,SCOL),乌头酸水合酶(Aconitate hydratase,ACO);④分子伴侣:热休克蛋白-27(heat shockprotein-27,HSP-27);肽酰脯胺酸顺反异构酶(peptidyl-prolyl cis-transisomerase A,PPIase);⑤信号转导分子:甲状腺素受体相互作用蛋白6(Thyroid receptor-interacting protein 6,TRIP6);⑥其它:髓鞘碱性蛋白S(myelin basic protein S,MBP),LIM结构域(LIM domain)。5、Western验证结果与蛋白质组学分析和鉴定基本一致,HSP27、SNX3、tubulin-alpha三种蛋白质均在PSD中呈免疫阳性,且它们在SRS、NSRS和Norm三组中的表达强度呈现出递增或递减现象,即HSP27:SRS＞NSRS＞Norm;tubulin-alpha:SRS＜NSRS＜Norm;SNX3:SRS＜NSRS＜Norm。研究结论:1、采用蔗糖梯度离心联合膜顺序提取法可获得高纯度和高溶解性的PSD蛋白,为深入研究PSD蛋白提供了技术基础。2、构建出大鼠脑组织PSD蛋白的2-D图谱,为PSD蛋白与相关疾病的研究奠定了基础。3、本研究筛选和鉴定出的TLE相关PSD蛋白,可能是促/抗TLE发病的重要候选蛋白分子。