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炎性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一种慢性肠道炎症性疾病,主要包括克罗恩病(Crohns disease,CD)和溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis,UC)。在IBD发病过程中,肠黏膜屏障功能受损,抗原移位刺激免疫细胞,产生大量炎性细胞因子及介质,炎性细胞因子进一步影响紧密连接蛋白的表达,使紧密连接复合物遭到破坏,引起肠上皮通透性增加。在这一过程肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)起到了非常重要的作用,研究发现炎症性肠病患者体内TNF-α异常增高,并伴随有肠屏障通透性的增高,而应用TNF-α抑制剂治疗后,这些患者肠屏障的通透性显著降低。目前TNF-α引起肠屏障通透性增高的具体机制仍不十分清楚。 紧密连接,又称封闭小带,是细胞与细胞之间的紧密相连的结构,液体分子不能通过,其主要由咬合蛋白Occludin、闭合蛋白Claudins和连接粘附分子(JAMs)三种完整的膜蛋白以及闭合小环蛋白(ZO-1、ZO-2、ZO-3)等外周胞浆蛋白组成。其中Claudin-1是很重要的一种紧密连接蛋白,对于屏障功能的维持和紧密连接的完整性起到了不可或缺的作用。 CUG结合蛋白1(CUG-binding protein1,CUGBP1)是RNA结合蛋白CELF家族的一员,其功能是通过与靶mRNA结合改变mRNA的稳定性和调节其翻译,对靶基因的表达进行调控。CUGBP1可以特异性识别靶mRNA中富含CUG的反应元件与之结合,调控靶基因的表达。CUG反应元件常位于mRNA的3’-非编码区,CUGBP1与之结合后主要通过促进靶mRNA的降解,抑制其翻译,调控其表达;也有研究发现CUGBP1可以与靶基因的编码区结合调控靶基因的表达。CUGBP1在细胞中主要存在与核内,它可以通过转位到胞浆中,与靶基因结合发挥调控作用。多种因素可以调控CUGBP1在细胞中的分布。 有研究报道,RNA结合蛋白CUGBP1在上皮组织中高度表达,生物信息学分析发现紧密连接蛋白claudin1mRNA的3’-非编码区存在CUG反应元件,表明其可能能与CUGBP1结合,受到其调控,从而影响肠粘膜屏障功能。因此,我们提出假设,在炎性肠病发生发展的过程中claudin1表达明显减少,而TNF-α在其中发挥重要作用,它可能通过促进RNA结合蛋白CUGBP1与Claudin-1mRNA的结合,促进其降解,降低Claudin-1蛋白的表达。紧密连接蛋白Claudin-1表达减少导致肠粘膜屏障功能障碍。 目的: 本课题拟探讨TNF-α通过CUGBP1/Claudin-1下调紧密连接蛋白Claudin-1的表达,进而破坏肠道紧密连接结构及其功能的机制。 方法: 本次实验中,我们首先用葡聚糖硫酸钠盐(Dextran Sulfate Sodium Salt,DSS)构建小鼠溃疡性结肠炎模型,结果显示DSS处理组小鼠出现体重减轻、稀便、血便、活动度下降。HE染色法对小鼠结肠部分进行组织学分析,发现DSS处理组小鼠出现明显的炎症浸润。Western Blot和免疫荧光检测到DSS处理组小鼠较对照组正常小鼠Claudin-1表达水平显著性降低。用全波长荧光酶标仪检测小鼠血中FD-40(FITC–dextran40kDa)的含量,与对照组小鼠相比,DSS组含量升高,表明DSS小鼠体内屏障通透性增加;在培养的人结肠癌细胞(Caco2)中,通过RT-PCR、WB和免疫荧光检测细胞中Claudin-1mRNA以及Claudin-1和CUGBP1蛋白水平的表达。研究发现TNF-α增加细胞的通透性,损害其屏障功能。TNF-α通过促进Claudin-1mRNA的降解,降低紧密连接蛋白Claudin-1的表达。CUGBP1能与Claudin-1mRNA结合,过表达CUGBP1,Claudin-1表达水平下降。且TNF-α可以刺激CUGBP1的出核,使其在胞浆内水平升高,进而促进CUGBP1与Claudin-1mRNA的结合。转染CUGBP1siRNA抑制CUGBP1之后,可以部分逆转TNF-α对Claudin-1蛋白表达的抑制作用。 结果与结论: DSS处理可导致明显的溃疡性结肠炎,动物体重减轻、稀便、血便明显,肠粘膜受损,通透性增加,紧密连接蛋白Claudin-1表达减少。TNF-α可以抑制Caco2细胞的屏障功能,通过促进Claudin1mRNA的降解,抑制Claudin1的表达。TNF-α可以调节RNA结合蛋白CUGBP1在细胞中的定位,促进其与Claudin1mRNA的结合。TNF-α通过促进CUGBP1的胞浆转位抑制紧密连接蛋白Claudin-1的表达,促进细胞的通透性,损害其屏障功能。这可能是促进IBD发生发展的原因之一。