他莫昔芬属于选择性雌激素受体调节剂(SERM),是乳腺癌内分泌辅助治疗的一线药物。然而,原发性和获得性他莫昔芬耐药导致的乳腺癌转移和死亡,严重制约了患者的生存预期。随着对乳腺癌他莫昔芬耐药的机制研究的逐渐深入,目前公认最核心的原因是雌激素受体(ERα)及其相关通路的异常调控。多项研究表明,ERα66的变化可能均与他莫昔芬耐药相关:包括ERα66表达缺失,突变或翻译后修饰等。雌激素受体α36(ERα36)是已知的ERα66变异体,但是ERα36参与乳腺癌他莫昔芬治疗抵抗的机制仍然知之甚少。乳腺癌干细胞(CSCs)为我们认识乳腺癌的进展提供了新的视角。乳腺癌干细胞标记物为CD44+/CD24-/low/ESA+或ALDH1high。雌二醇和他莫昔芬处理均可以促进正常乳腺上皮干细胞和乳腺癌干细胞数量及比例增加。但是,乳腺癌CSCs并不表达ERα66。所以,尚不清楚雌二醇或者他莫昔芬调控乳腺癌CSCs的作用靶点及具体机制。因此,研究他莫昔芬诱导乳腺癌CSCs功能维持的分子机制具有重要的价值。ERα36是ERα家族成员,属于ERα66剪接体,在ALDH1high的乳腺癌CSCs上呈现显著高表达。既往研究显示,ERα36与雌激素基因组和非基因组信号通路均有相关性,通过PI3K/Akt和MAPK/ERK途径,激活下游激酶如c-Jun N-末端激酶(JNK)和细胞内Ca2+动员活性,参与乳腺癌细胞的增殖和侵袭活性。ERα36在乳腺正常腺体与乳腺癌组织有广泛的表达,并且呈现出一定的分布规律。因此,ERα36应该具有更广泛的病理生理学活性。对乳腺癌恶性生物学行为的调控机理,尤其是乳腺癌干细胞的调控机制需要深入研究。ERα66是临床选择他莫昔芬进行内分泌治疗的唯一生物标志物。临床试验表明,他莫昔芬可能诱导具有CSC表型的侵袭性肿瘤进展。因此,对于乳腺癌患者的内分泌治疗用药,也需要进一步的分子分型以实现个体化治疗。因此,本研究中,基于ERα36膜定位受体,我们利用荧光激活细胞分选(FACS)技术,从乳腺癌异质细胞群中分选获得了ERα36+细胞,研究了他莫昔芬治疗期间,由ERα36驱动乳腺癌转移的现象与机制。此外,我们建立了乳腺癌标本数据库,结合详细的临床信息,彻底地研究了ERα36的表达分布特点及其临床意义。本课题的主要研究内容和主要结果结论如下:一、多中心大样本人乳腺癌研究显示erα36高表达的乳腺癌患者预后不良,他莫昔芬治疗增加erα36阳性乳腺癌的转移。1.erα36高表达乳腺癌是转移和预后差的标志物我们利用erα36的特异肽段构建了特异性erα36单克隆抗体。运用免疫组化技术,检测了四个独立研究队列合计1537例乳腺癌组织的erα36表达情况,并建立了乳腺癌研究数据库(http://swcc.xnyy.cn/clinical)。我们证明了erα36+的肿瘤患者更倾向于出现转移,且生存期缩短,erα36的表达是乳腺癌预后差的危险因素。2.他莫昔芬治疗会增加erα36+乳腺癌患者的转移,缩短生存预期我们探讨了erα36表达与乳腺癌内分泌治疗相关的转移的相关性,发现相比患者erα36-肿瘤患者,erα36+肿瘤患者接受他莫昔芬治疗后无转移生存期明显缩短(mfs)。此外,相比未接受他莫昔芬治疗erα36+乳腺癌患者,接受他莫昔芬治疗后mfs显著缩短。对342例erα36和erα66双阳性乳腺癌患者的多元回归分析显示,他莫昔芬治疗对该群患者dfs和mfs呈负性影响。通过分析另外三个独立样本组,我们进一步发现erα36+患者与erα36-患者接受他莫昔芬治疗反应的风险比为13.67(95%ci,3.31-56.45)。erα36+肿瘤患者接受他莫昔芬治疗相比在其他疗法的风险比为3.21(95%ci,1.38?7.44)。进一步提示erα36参与了他莫昔芬诱导的乳腺癌转移进展。3.芳香化酶抑制剂治疗使erα36+乳腺癌患者受益通过对erα36和erα66双阳性乳腺癌患者的数据分析发现,使用ais治疗后其无转移生存期比他莫昔芬治疗组显著延长。而且,接受ais治疗的erα36+和erα36-乳腺癌患者,其mfs并没有显著的差异。回归分析表明,他莫昔芬治疗降低了erα66+/erα36+的绝经后乳腺癌患者dfs,说明芳香化酶抑制剂可以改善erα36+阳性乳腺癌患者的预后。二、他莫昔芬可以激活erα36+乳腺癌细胞的恶性表型1.他莫昔芬激活erα36增加乳腺癌细胞的增殖和转移我们构建了不同erα36表达水平的乳腺癌细胞,在体内、体外他莫昔芬的处理下,erα36+乳腺癌细胞表现出显著增强的增殖、侵袭和转移能力,提示他莫昔芬可激活erα36增强乳腺癌细胞恶性生物学表型。2.erα36参与维持乳腺癌干细胞特性通过对高表达erα36的乳腺癌细胞的干性特征检测,我们发现erα36阳性乳腺癌细胞表现出更强的自我更新能力、成瘤能力和侵袭转移能力。通过对临床标本的进一步检测,我们发现erα36与乳腺癌干细胞标记物aldh1a1存在显著的共表达现象,高度提示erα36可能在乳腺癌干细胞的维持中发挥作用。3.他莫昔芬增强erα36+细胞的干细胞样特性,增加aldh1a1的表达我们检测了他莫昔芬对高表达erα36的乳腺癌细胞的干性特征检测。体外和体内实验表明,他莫昔芬可以显著提高erα36+细胞的自我更新能力。并且,显著富集了乳腺癌aldh1high亚群,并且直接增加了aldh1a1基因的表达。三、他莫昔芬激活erα36,后者上调aldh1a1的基因转录和蛋白表达。1.他莫昔芬激活erα36参与雌激素基因组信号通路的调控通过对4-oht处理的mcf-7-erα36+/-细胞的基因表达分析,我们发现细胞粘附分子(cams)家族受到显著调控,而且干性相关基因在erα36+细胞呈现显著高表达。更重要的是,erα36+细胞低表达erα66基因,但是他莫昔芬处理后,雌激素/erα基因组信号通路的靶基因显著高表达。2.他莫昔芬激活erα36调节aldh1a1表达既往研究对erα36能否与配体结合仍存在争议。我们采用计算模拟的方法和配体结合实验,证明了他莫昔芬和17-β雌二醇可以与erα36的结合。在他莫昔芬处理后20-40分钟,我们检测到erα36从膜或细胞质向胞核转位。进一步的实验证明erα36-ser132的磷酸化在erα36的细胞核转位中发挥重要作用。发生核转位的erα36可以与基因组的ere位点结合,发挥核转录因子的活性,直接调控aldh1a1的转录。四、抑制aldh1a1或靶向erα36减少他莫昔芬诱发乳腺癌增殖和转移使用二乙氨基苯(deab)或双硫仑(ds)抑制aldh1a1的活性,我们发现两者均可以显著降低乳腺癌细胞的自我更新能力、成瘤能力和侵袭转移能力。另外,我们使用erα36单克隆抗体同样可以显著抑制erα36介导的乳腺癌生长与转移。我们的研究结果支持靶向aldh1a1或erα36进行cscs靶向治疗,两者具有潜在的临床治疗价值。综上所述,本研究的主要结论是:一、从机制研究方面,我们首次发现他莫昔芬可以结合并激活erα36,调控雌激素基因组信号通路,上调乳腺癌干细胞aldh1a1的表达。1.erα36可以与配体(雌二醇和他莫昔芬)结合,而且他莫昔芬可以发挥激活剂活性;2.erα36通过配体依赖的方式激活基因组信号通路,磷酸化后发生核转位,发挥核转录因子的活性;3.erα36可以直接调控aldh1a1的表达,来维持乳腺癌干细胞的自我更新能力。二、从病理诊断方面,我们发现erα36在乳腺癌表达对乳腺癌分子分型的价值,并对内分泌治疗药物选择提供了依据。1.ERα36是乳腺癌转移新的分子标志物,提示ERα36+乳腺癌是乳腺癌的重要分子亚型;2.他莫昔芬治疗可以促进ERα36阳性乳腺癌的转移,提示他莫昔芬应该从ERα36+乳腺癌的治疗药物中剔除。三、从治疗新策略方面,我们发现ERα36和ALDH1A1均可以作为靶向乳腺癌干细胞治疗的潜在靶点。1.ERα36阳性乳腺癌对芳香化酶抑制剂的治疗敏感,是内分泌治疗药物选择的重要依据;2.靶向ALDH1A1和ERα36可以显著控制乳腺癌的转移,是潜在的预防治疗乳腺癌转移的重要靶点。上述研究不仅揭示了ERα36介导他莫昔芬促乳腺癌转移的分子机制,而且为乳腺癌分子分型和个体化治疗新方法提供了重要依据。