木质纤维素是地球上储量最丰富的可再生资源,其高效降解转化对于可持续发展至关重要。然而木质纤维素具有多层次复杂的致密结构,形成了“生物质抗降解屏障”。研究发现,天然生境中长期进化已经形成相对高效的微生物群落及其降解酶系统,但其效率仍不能满足生产实际中木质纤维素高效转化的需求,因此认识木质纤维素不同层次不同结构组分与微生物降解酶系之间的关系,发现木质纤维素结构层次与微生物及酶系之间的调控规律,找到木质纤维素高效降解转化的限速步骤等,对于提高木质纤维素的降解转化效率,形成绿色转化工艺至关重要。组学研究发现,自然界木质纤维素利用系统通常由多种微生物构成的群落而不是单一微生物组成,这些微生物是如何感知不溶性木质纤维素的结构层次、如何定量协调并形成高效协同降解机制的相关研究仍不深入。此外,工业应用中嗜热微生物与耐热酶系具有显著的优势,因此全面认识并构建人工高温微生物组合以完成木质纤维素的高效降解转化,已成为新的研究热点。基于以上科学问题,本文以高温堆肥中的优势功能微生物区系为研究对象,对相关微生物的酶系组成、降解底物类型的偏好性、对还原糖的代谢利用能力以及木质纤维素降解转化过程中可能的限速步骤等展开研究,从而认识不同高温微生物在木质纤维素降解过程中的协同调控机制及相关规律。取得如下主要研究成果:1.利用比较基因组学方法分析了高温木质纤维素堆肥中代表性优势嗜热微生物降解木质纤维素的潜能嗜热真菌疏棉状嗜热丝孢菌是高温堆肥生境中的优势丝状真菌,其基因组大小为19.16 Mb,比其它丝状真菌要小1/3,编码的木质纤维素降解相关蛋白仅有52种。其中半纤维素降解酶类较多,主要是β-1,3;1,4-葡聚糖与甘露寡糖降解相关蛋白。分析发现,疏棉状嗜热丝孢菌基因组不编码纤维素水解酶类,却含有氧化酶相关基因。对于嗜热放线菌褐色喜热裂孢菌的基因组分析显示,该菌总共编码27种木质纤维素降解相关蛋白,其中纤维素降解酶类最多,包括2种外切纤维素酶、8种内切纤维素酶、3种β-葡萄糖苷酶及2种氧化降解酶类(LPMOs),同时该菌具有丰富的木聚糖降解酶系统,包含3种内切木聚糖酶,1种木糖苷酶和3种侧链降解酶。此外,该菌还编码5种其它木质纤维素降解酶类。2.利用功能蛋白质组学方法揭示疏棉状嗜热丝孢菌的底物降解偏好性及其还原糖代谢利用能力利用功能组学方法分析了疏棉状嗜热丝孢菌对13种不同碳源的代谢利用能力及其诱导分泌蛋白的特征。结果表明该菌偏好利用可溶性糖进行生长。在其分泌组中检测到13种表达水平较高的糖苷水解酶类,其中9种是还原糖糖苷酶;另外,鉴定到10种表达水平较高的蛋白酶类,其中7种为外肽酶。这表明该丝状真菌可以利用腐生生境中的寡糖和寡肽来快速生长。聚糖降解酶类主要受木聚糖特异性诱导,主要分泌1种GH11家族的木聚糖酶,降解木聚糖形成可溶性木寡糖,其中无侧链取代基的木寡糖(XOS)被菌体快速吸收并利用。由于该菌不分泌木聚糖侧链降解酶类,因而带侧链的木寡糖(SXOS)未能进一步被菌体降解和利用,导致该类木寡糖在胞外明显积累(占总木聚糖含量8%)。SXOS是重要的益生元,疏棉状嗜热丝孢菌可以以低值玉米秸秆为原料,生产嗜热微生物菌剂、耐热木聚糖酶制剂以及高值益生元,因而具有工业应用推广的潜力。3.利用功能蛋白质组学方法揭示褐色喜热裂孢菌的底物降解偏好性及其还原糖代谢利用能力功能组学研究结果表明,纤维素可以诱导褐色喜热裂孢菌分泌一系列纤维素降解酶类(包括2种外切纤维素酶,4种内切纤维素酶和1种LPMO),并且菌体可以利用纤维素的降解产物进行生长。以木聚糖为底物培养褐色喜热裂孢菌,分泌组中主要检测到1种GH11家族的木聚糖酶(相对表达量为8.71±3.83%)以及1种GH10家族的木聚糖酶(相对表达量为4.5±1.23%),且这些木聚糖酶可以在2min内快速将木聚糖降解成高浓度木寡糖和木糖。但是以不同浓度的木寡糖和木糖为碳源培养褐色喜热裂孢菌时,结果显示浓度高于0.5%(w/v)的木寡糖和木糖明显抑制该菌的生长和产酶。这表明该菌基因组编码丰富的木聚糖降解酶系,并且可以被高效诱导分泌到胞外,然而木聚糖降解产物中高浓度木寡糖及木糖却明显抑制菌体的生长。暗示了该菌具有高效的木聚糖降解能力,却没有高效吸收利用木聚糖降解产物的能力,这就可以初步解析该菌不能以天然玉米秸秆固体培养基为底物单独生长的原因。因此该菌作为高温堆肥中的优势功能微生物,在天然玉米秸秆堆肥生境中应该与其它嗜热微生物存在协同关系。4.利用功能组学技术解析了疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌协同降解木质纤维素的机理,证明木聚糖降解产物的浓度可调节它们之间的协同以纤维素与不同浓度木聚糖降解产物的组合为碳源培养疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌,对它们的生长产酶以及协同机制进行了研究分析。结果显示,疏棉状嗜热丝孢菌可以快速利用高浓度木寡糖,因而可能有利于解除高浓度木寡糖对褐色喜热裂孢菌的生长抑制。在两菌构建的共培养体系中,疏棉状嗜热丝孢菌在共培养前期快速生长,分泌1种GH11家族木聚糖酶降解不溶性木质纤维素外层的木聚糖;而褐色喜热裂孢菌在后期快速生长,主要分泌大量木聚糖酶及纤维素酶,木聚糖酶降解木质纤维素形成的木寡糖及木糖促进疏棉状嗜热丝孢菌进一步快速生长,以去除木聚糖等,促使纤维素快速暴露,褐色喜热裂孢菌分泌的纤维素酶系可以将纤维素高效降解并吸收利用。研究发现,疏棉状嗜热丝孢菌和褐色喜热裂孢菌对木聚糖降解产生的还原糖浓度响应呈现负相关,即高浓度的木寡糖促进疏棉状嗜热丝孢菌的生长,抑制褐色喜热裂孢菌的生长;而低浓度的木寡糖是木质纤维素中半纤维素减少、不溶性纤维素暴露的信号,可促进褐色喜热裂孢菌快速生长。因此,生境中木聚糖降解产物的浓度,尤其是木寡糖的浓度调节了具有不同底物降解偏好性两类微生物的生长和产酶,这是微生物群落长期共同进化适应的结果。本研究构建了 55℃条件下嗜热真菌和放线菌的共培养组合,并定位了木寡糖浓度是调节其生长的关键因素,这为人工构建其它高温高效降解木质纤维素的微生物组合提供了新思路。5.基于转录定量分析与蛋白异源表达方法,解析了褐色喜热裂孢菌中与纤维素酶共同表达的GH10家族木聚糖酶及其组分的功能通过定量PCR测定,对褐色喜热裂孢菌重要糖苷水解酶在不同底物上的转录表达水平进行了分析,并重点对与纤维素酶共同表达的GH10家族木聚糖酶进行了异源表达。结果表明,木聚糖特异性诱导褐色喜热裂孢菌分泌GH11家族的木聚糖酶Xyl11A,而纤维素特异性诱导一种GH10家族木聚糖酶Xyl1OA的分泌。Xyl10A与纤维素酶在纤维素诱导条件下共表达,并且Xyl1OA带有高效结合结晶纤维素的CBM2,表明Xyl1OA是结合纤维素表面并降解木聚糖的酶类。酶学性质测定显示,Xyl1OA的最适温度为80℃,最适pH为9,是一种即耐热又耐碱的木聚糖酶,表明该酶在纸浆漂白等工业应用中应有巨大潜力。6.基于结构生物信息学方法,初步阐明了褐色喜热裂孢菌Xyl10A与底物相互作用的结构基础及提高酶活的途径基于结构生物信息学指导,探究了 Xyl1OA活性架构中心氨基酸残基与底物相互作用的机制。研究分析显示,GH10家族蛋白活性架构中心结合底物的亚位点是-3到+2,共有18个氨基酸残基与之发生相互作用,其中12个氨基酸残基集中在-2和-1亚位点,且整体保守性较高。将其突变为丙氨酸后,突变体酶与底物的结合能力、相对酶活都明显下降,这表明-2和-1亚位点氨基酸残基是该酶高效结合底物的主要功能区域。由于+1亚位点基本没有参与识别并结合底物糖单元的功能残基,因此该亚位点木聚糖链处可以容纳侧链取代基,这是GH10家族木聚糖可以高效降解带侧链木聚糖的结构基础。值得注意的是,与远端-3亚位点糖环相互作用的氨基酸51E突变为丙氨酸后,突变体酶相对酶活性明显提高了 90%以上,说明该家族相关酶类的改造策略应与GH11家族加大远端亚位点的结合力不同,GH10家族蛋白的改造方向是减小远端亚位点氨基酸与底物的结合力,相关分析初步阐明了 GH10家族木聚糖酶与底物相互作用的结构特征,并为该家族蛋白的进一步改造提供了方向。