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黑果枸杞(Lycium ruthenicum Murr.)是一种多年生茄科(Solaanceae)枸杞属(Lycium)灌木,广泛分布于青藏高原盐渍化地区。黑果枸杞的主要成分是多酚、黄酮和花色苷。阿霉素(Doxorubicin,Dox)作为一种有效的抗肿瘤药物,在临床使用中仍是大多数化疗方案的强效药物,然而在临床使用时伴随的器官毒性不容忽视。因此,采用新的疗法降低Dox诱导的器官毒性而不影响抗肿瘤活性具有极大的医学价值。黑果枸杞花色苷的药理活性主要包括抗氧化、清除自由基和预防心血管疾病等。因此,黑果枸杞花色苷的提取分离、分析鉴定和生物活性研究对黑果枸杞的开发利用具有重要意义。本实验的主要研究内容如下:1.本实验采用酶辅助提取法提取黑果枸杞花色苷,分别考察了提取温度、提取时间、pH值、果胶酶用量和料液比对黑果枸杞花色苷提取率的影响。在单因素实验的基础上,采用响应面法优化了酶辅助提取黑果枸杞花色苷的工艺。最佳提取条件为:提取温度38.21℃,提取时间37.27 min,果胶酶用量52.04 mg/100 g,在此条件下黑果枸杞花色苷的提取率为19.51±0.21 mg/g。黑果枸杞总多酚最佳提取条件:提取温度50℃,提取时间45.65 min,果胶酶用量60 mg/100 g。在此条件下,总多酚的提取率为268.67±3.52 mg/g。2.建立了一种黑果枸杞花色苷分离纯化的方法。采用静态吸附/解吸实验筛选出分离纯化的XDA-6型大孔吸附树脂。采用动态吸附/解吸实验得到大孔树脂分离纯化黑果枸杞花色苷上样工艺:径高比1:20,上样液比重为0.647±0.024 mg/ml,上样量为22.3 BV,流速1 mL/min;洗脱工艺为:依次用水(0.1%HCl,v/v)和70%乙醇水(0.1%HCl,v/v)梯度洗脱,用量均为4 BV,洗脱流速为2 BV/h。所得产品黑果枸杞花色苷含量16.57%。3.根据HPLC-DAD和HPLC-ESI-MS/MS数据,本实验从黑果枸杞中分离鉴定出13种花色苷。其中矮牵牛素-3-O-(反式-香豆酰基)-芸香糖苷-5-O-葡萄糖苷为黑果枸杞中含量最高的花色苷。4.通过DPPH清除自由基实验、羟基自由基清除实验和ABTS自由基清除实验,测定了黑果枸杞花色苷的抗氧化活性。结果表明纯化后的黑果枸杞花色苷的抗氧化活性显著高于黑果枸杞花色苷粗提物。5.黑果枸杞花色苷对Dox诱导的小鼠心脏毒性缓解作用研究表明,黑果枸杞花色苷能显著降低Dox诱导的血清中肌酸激酶-同工酶(CK-MB)和乳酸脱氢酶(LDH)水平的升高。同时,黑果枸杞花色苷能显著降低心脏组织中丙二醛(MDA)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白介素1β(IL-1β)的水平,并显著提高超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽(GSH)的酶活性。心脏病理切片显示,黑果枸杞花色苷能改善炎性细胞浸润和心肌纤维断裂。对凋亡蛋白表达测定发现,黑果枸杞花色苷能够下调Dox诱导的心脏组织中Bax和Caspase-9蛋白的表达,上调Bcl-2的表达。因此,黑果花色苷通过减轻氧化应激和炎症反应,调节Bax/Bcl-2介导的线粒体凋亡信号来抑制细胞凋亡,从而对Dox诱导的心脏毒性进行保护。6.黑果枸杞花色苷对Dox诱导的小鼠肝肾毒性缓解作用研究表明,黑果枸杞花色苷能显著降低Dox诱导的血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酐(Cr)和血尿素氮(BUN)水平的升高。同时,黑果枸杞花色苷显著降低肝肾组织中脂质过氧化物MDA、炎症因子TNF-α和IL-1β的水平,并显著提高抗氧化酶SOD和GSH的酶活性。肝肾组织病理切片显示黑果构杞花色苷能够改善Dox诱导的肝肾组织间质性血管扩张和炎症细胞浸润。为了探究黑果花色苷对细胞凋亡通路的影响,通过蛋白印迹法测定了肝肾组织中促凋亡蛋白Bax、Caspase-9和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达。结果表明,黑果枸杞花色苷能够下调Dox诱导的肝肾组织中Bax和Caspase-9蛋白的表达,上调Bcl-2的表达。因此,黑果花色苷通过减轻氧化应激反应和炎症反应,调节Bax/Bcl-2介导的线粒体凋亡信号来抑制细胞凋亡,从而缓解Dox诱导的肝肾毒性。