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西瓜(Citrullus lanatus)是重要的葫芦科作物,具有较高的经济价值。西瓜是典型的喜温作物,在早春和反季节设施栽培过程中,常受到低温胁迫而影响产量和经济效益。低温已成为西瓜生产中主要的非生物限制因子,严重制约西瓜的周年供应和种植效益提高。MYB转录因子在植物应答外界胁迫环境中起着重要作用,参与调控下游多个基因的表达。本课题前期研究中,通过挖掘低温胁迫下西瓜转录组数据发现多个基因参与低温逆境响应。进一步分析得出,Cla005622的表达量显著上调,且属于MYB-related型转录因子,但其耐低温功能及相关调控作用尚未明确。为回答上述问题,本研究拟采用如下方法解决:对MYB-related家族成员鉴定、分析Cla005622的结构特征、qRT-PCR鉴定Cla005622对西瓜低温胁迫的应答、亚细胞定位和转录活性鉴定Cla005622的特征、超量表达与烟草遗传转化后鉴定耐低温性功能验证、酵母双杂交探究蛋白互作及功能分析,旨在明确Cla005622对西瓜低温逆境的耐低温功能鉴定及调控作用,结果不仅可以解析西瓜的低温耐受性机制,同时还可为后续从分子育种角度改善西瓜低温抗性、提高西瓜产量与质量提供丰富的基因资源。本文的主要研究结果如下:1.Cla005622基因结构分析及西瓜MYB-related家族基因成员鉴定。使用NCBI预测Cla005622蛋白保守结构域得知,其属于典型的MYB-related基因。为进一步探索其在MYB-related家族基因中的特征,通过HMM算法在西瓜全基因组上共鉴定出50个MYB-related家族基因,编码序列长度240bp-4986bp,等电点4.8-9.97,分子量5890.67-181178.4。据基因在染色体上的分布顺序命名为ClMYB1-ClMYB50。Cla005622对应基因为ClMYB46,编码序列全长1040bp,编码334个氨基酸,等电点为6.70,分子量为35890.61,位于第10号染色体。2.ClMYB46对西瓜低温逆境的应答。以西瓜97103为实验材料,用qRT-PCR技术检测10℃低温处理西瓜叶片后6h、12h、24h、48h的基因表达量变化,变化趋势呈现先升高后降低再升高的过程。其中,6h点的表达量达到最高。因此,ClMYB46受低温胁迫诱导显著上调表达。3.ClMYB46的特征分析。亚细胞定位以本氏烟草为实验材料,构建载体GV3101[pH7LIC5.0-N-eGFP-ClMYB46]后瞬时表达,观测荧光信号位于细胞核。转录活性鉴定通过构建Y2HGold[pGBKT7-ClMYB46],激活HIS3、ADE2报告基因表达,具有转录活性。因此,ClMYB46表达部位在细胞核,且具有转录活性。4.ClMYB46的耐低温性功能鉴定。以野生栽培烟草为实验材料,构建载体LBA4404[pHellsgate8-ClMYB46]后进行烟草遗传转化,qRT-PCR检测ClMYB46表达量,筛选OE1、OE2株系进行后续实验。以野生型烟草WT、转基因株系OE1和OE2各75株为实验材料,4℃低温处理(光周期16 h/8 h,光强100μmol m-2s-1)0h、6h、12h、24h、48h时间点观察并取样。表型观察、冷害指数测定均得出不同时间点下野生型株系萎蔫程度均高于转基因株系,过表达ClMYB46能提高烟草对低温逆境的抗性。使用试剂盒测定不同时间点下电导率和丙二醛含量变化得知野生型细胞膜受损伤更严重,过表达ClMYB46能提高烟草对低温逆境的抗性。以低温处理不同时间点下野生型烟草WT、转基因株系OE1和OE2为材料,qRT-PCR检测ABA信号转导途径相关基因(rab18、ABI1、ABI2)与冷胁迫相关基因(DREB转录因子DREB2A、脯氨酸合成促进基因P5CS)的表达量变化。ClMYB46上调引起rab18上调表达、ABI1、ABI2下调表达、DREB2A、P5CS上调表达。5.ClMYB46互作蛋白筛选及点对点验证。重组构建无毒性的诱饵载体Y2HGold[pGBKT7-ClMYB46],AbA抑制其自激活后Mating法筛库鉴定并测序。初步筛选出10个有功能的互作蛋白,包含:维持细胞内环境离子平衡、盐胁迫响应、维持离子通道平衡、响应ABA信号转导途径、参与茉莉酸胁迫响应。其中,ClMYB46的互作蛋白Cla014285(AtCPK28)参与蛋白磷酸化途径、ABA信号转导途径、Ca2+信号转导途径从而引起植株对逆境胁迫的响应。