随着国内外畜禽养殖集约化程度的不断提高,大量使用抗菌素治疗动物群发性疾病导致细菌耐药性增加和动物性食品药物残留等问题日趋严重的情况下,开发绿色安全的新型饲料添加剂来代替抗菌素预防动物群发性疾病已成为畜牧业健康发展的必然趋势。中草药制剂和微生态制剂具有作用广泛和毒副作用小等优点,在代替抗菌素成为新型饲料添加剂方面具有巨大的应用前景。本研究选取25周龄金定蛋鸭800只,随机分成8组,每组5个重复,每个重复20只。对照组饲喂基础饲粮,试验1组在基础饲粮中添加1.5 g/kg益生菌(肽优康),试验2～4组在基础饲粮中添加1、1.5和2 g/kg辣木叶黄酮,试验5～7组在基础饲粮中添加1.5 g/kg益生菌后,再分别添加1、1.5和2 g/kg的辣木叶黄酮。预试期1周,正试期8周。探究辣木叶黄酮和益生菌在单独使用或联合使用的情况下对蛋鸭生产性能、蛋品质、抗氧化性能、脂质代谢、免疫功能及肠道微生物的影响,旨在将辣木叶黄酮和益生菌开发成为新型饲料添加剂奠定理论基础。1.辣木叶黄酮和益生菌对蛋鸭生产性能及蛋品质的影响蛋鸭饲养试验期间以重复为单位,每天计算产蛋率、平均日采食量、料蛋比、平均蛋重和破蛋率;饲养试验结束后,在每个重复中随机抽取6枚鸭蛋,对蛋形指数、蛋壳强度、蛋黄颜色、蛋黄百分比、蛋壳厚度以及哈夫单位进行测定。结果显示:与对照组相比,试验1组平均蛋重和料蛋比分别降低14.2%和5.1%(p<0.05),产蛋率、平均日采食量和破蛋率与对照组相比无显著差异(p>0.05);与对照组相比,试验2、3、4、5和6组对蛋鸭生产性能无显著改善作用(p>0.05);与对照组相比,试验7组平均蛋重、平均日采食量、料蛋比和破蛋率无显著差异(p>0.05),产蛋率降低5.8%(p<0.05)。试验1、3和4组蛋品质与对照组相比无显著差异(p>0.05);试验2组蛋形指数、蛋黄颜色、蛋壳厚度和哈夫单位与对照组相比无显著差异(p>0.05),蛋壳强度提高15.9%(p<0.05),蛋黄百分比降低7.3%(p<0.05);试验5、6和7组蛋形指数、蛋黄百分比、蛋壳厚度、哈夫单位与对照组相比无显著差异(p>0.05),蛋壳强度分别增强13.7%、10.0%和13.6%(p<0.05),试验5和6组蛋黄颜色分别提高3.2%和2.7%(p<0.05),试验7组与对照组相比蛋黄颜色无显著差异(p>0.05)。结果表明:基础饲粮中单独添加辣木叶黄酮或益生菌对提高蛋鸭生产性能效果不明显;辣木叶黄酮和益生菌联合应用对蛋壳强度有显著增强作用,以试验7组(1.5 g/kg益生菌+2.0 g/kg辣木叶黄酮)效果最佳。2.辣木叶黄酮和益生菌对蛋鸭脂质代谢的影响饲养试验结束后,每个重复随机抽取3只蛋鸭和3枚鸭蛋。蛋鸭翅静脉采血后分离血清;鸭蛋分离蛋黄后,将蛋黄搅匀抽取2 m L于EP管中,-20℃保存备用。采用ELISA方法对蛋鸭血清和蛋黄中甘油三脂(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)进行检测。采集蛋鸭肝脏在液氮中速冻后置于-80℃冰箱中保存备用,采用q PCR(染料法)方法检测3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMG-COA)m RNA在蛋鸭肝脏中的表达量。结果显示:1)与对照组相比,试验1组蛋鸭血清TG和LDL-C含量分别降低14.5%和23.9%(p<0.05),HDL-C含量上升17.8%(p<0.05),蛋鸭血清TC含量与对照组相比无显著差异(p>0.05)。试验2组蛋鸭血清TG、TC、HDL-C和LDL-C含量与对照组相比无显著差异(p>0.05)。试验3组蛋鸭血清TG、TC、LDL-C与对照组相比无显著差异(p>0.05),HDL-C含量提高14.6%(p<0.05)。与对照组相比,试验4组蛋鸭血清TC和LDL-C含量无显著差异(p>0.05),TG含量降低13.4%(p<0.05),HDL-C含量上升20.7%(p<0.05)。与对照组相比,试验5、6和7组蛋鸭血清TG分别降低21.4%、13.3%和19.4%(p<0.05),TC分别降低25.7%、35.1%和18.9%(p<0.05),LDL-C分别降低33.8%、47.5%和27.4%(p<0.05),HDL-C含量分别增加28.8%、31.9%、24.0%(p<0.05)。2)与对照组相比,试验1组鸭蛋蛋黄中TG、TC和LDL-C含量分别降低22.2%、10.0%和22.6%(p<0.05),HDL-C含量上升16.7%(p<0.05);与对照组相比,试验2组鸭蛋蛋黄中TG、TC、HDL-C和LDL-C含量无显著差异(p>0.05);与对照组相比,试验3组鸭蛋蛋黄TG、TC和HDL-C含量无显著差异(p>0.05),LDL-C含量降低11.9%(p<0.05);与对照组相比,试验4组鸭蛋蛋黄TG含量无显著性差异(p>0.05),TC和LDL-C含量分别降低20.0%和16.7%(p<0.05),HDL-C含量提高16.7%(p<0.05);与对照组相比,试验5、6和7组鸭蛋蛋黄TG分别降低22.2%、22.2%和11.1%(p<0.05),TC分别降低30.0%、20.0%和20.0%(p<0.05),LDL-C分别降低29.8%、36.9%和23.8%(p<0.05),HDL-C含量分别增加23.1%、23.1%、16.7%(p<0.05)。3)试验1～7组HMG-COA还原酶m RNA相对表达量与对照组相比分别降低8.9%、27.7%、27.7%、26.7%、35.6%、38.6%和43.6%(p<0.05)。结果表明:1)辣木叶黄酮和益生菌联合运用可显著降低蛋鸭血清和鸭蛋蛋黄中TG、TC和LDL-C含量,并显著升高蛋鸭血清和鸭蛋蛋黄HDL-C含量,以试验6组(1.5 g/kg益生菌+1.5 g/kg辣木叶黄酮)效果最佳。2)基础饲粮中单独添加辣木叶黄酮或益生菌均可显著抑制肝脏中HMG-COA还原酶m RNA的表达,两者联合使用时抑制效果更强,其中以试验7组(1.5 g/kg益生菌+2.0 g/kg辣木叶黄酮)抑制效果最明显。3.辣木叶黄酮和益生菌对蛋鸭抗氧化及免疫功能的影响采用ELISA方法对蛋鸭血清、鸭蛋蛋黄中抗氧化指标(丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px))和免疫功能指标(IgG、IgA、IgM、十二指肠s IgA以及血清IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γ)进行检测。另采集蛋鸭脾脏在液氮中速冻后置于-80℃冰箱中保存备用,采用q PCR(染料法)方法检测脾脏中IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γm RNA的相对表达量。结果显示:1)与对照组相比,试验1组蛋鸭血清中MDA含量降低24.5%(p<0.05),SOD和GSH-Px活性分别升高30.1%和16.5%(P<0.05);试验2和3组蛋鸭血清MDA含量、SOD和GSH-Px活性与对照组相比无显著差异(p>0.05);与对照组相比,试验4组蛋鸭血清MDA含量无显著变化(p>0.05),SOD和GSH-Px活性与对照组相比分别增加23.7%和12.5%(p<0.05);与对照组相比,试验5、6和7组蛋鸭血清MDA含量分别降低29.3%、32.8%和20.8%(p<0.05),SOD活性分别升高40.8%、41.8%和23.6%(p<0.05),GSH-Px活性分别升高19.6%、27.0%和20.6%(p<0.05)。2)与对照组相比,试验1组鸭蛋蛋黄中MDA含量降低23.9%(p<0.05),SOD活性升高35.0%(P<0.05),GSH-Px活性与对照组相比无显著差异(p>0.05);试验2组鸭蛋蛋黄MDA含量、SOD和GSH-Px活性与对照组相比无显著差异(p>0.05);试验3组鸭蛋蛋黄中MDA含量和GSH-Px活性与对照组相比无显著差异(p>0.05),SOD活性升高23.2%(p<0.05);与对照组相比,试验4、5、6和7组鸭蛋蛋黄中MDA含量分别降低16.6%、37.5%、34.1%和25.0%(p<0.05),SOD活性分别升高30.5%、49.4%、47.8%和32.2%(p<0.05),GSH-Px活性分别升高13.4%、21.6%、26.6%和21.6%(p<0.05)。3)试验1组蛋鸭血清IgG、IgA、IgM和十二指肠中s IgA含量与对照组相比分别增加20.5%、36.2%、27.7%和50.5%(p<0.05);试验2组蛋鸭血清IgG、IgA、IgM和十二指肠中s IgA含量与对照组相比无显著差异(p>0.05);试验3组蛋鸭血清IgG和IgM含量与对照组相比无显著差异(p>0.05),蛋鸭血清IgA和十二指肠s IgA含量分别增加28.6%和29.5%(p<0.05);试验4、5、6和7组蛋鸭血清IgG、IgA、IgM和十二指肠s IgA含量显著增加,试验4组分别增加14.2%、32.2%、26.2%和39.6%(p<0.05),试验5组分别增加30.9%、50.0%、37.7%和52.1%(p<0.05),试验6组分别增加29.8%、43.2%、43.0%和53.1%(p<0.05),试验7组分别增加23.2%、40.8%、34.7%和55.6%(p<0.05)。4)各试验组蛋鸭血清IL-2和IL-6含量与对照组相比无显著差异(p>0.05);与对照组相比,试验1、3、5、6和7组,蛋鸭血清IL-4含量分别增加18.3%、14.1%、16.5%、20.7%和28.1%(p<0.05),试验2和4组蛋鸭血清IL-4含量与对照组相比无显著差异(p>0.05);试验1、2、3、4和7组蛋鸭血清IFN-γ含量与对照组相比无显著差异(p>0.05),试验5和6组蛋鸭血清IFN-γ含量与对照组相比分别增加23.2%和27.5%(p<0.05)。5)试验1和2组脾脏IL-2、IL-6和IFN-γm RNA相对表达量与对照组相比无显著差异(p>0.05),脾脏IL-4 m RNA相对表达量分别上调31.5%和29.1%(p<0.05);试验3、4和7组脾脏IL-2和IL-6 m RNA相对表达量与对照组相比无显著差异(p>0.05),IL-4 m RNA相对表达量分别上调38.3%、34.2%和40.5%(p<0.05),IFN-γm RNA相对表达量分别上调27.5%、23.7%和30.4%(p<0.05);试验5组脾脏IL-2 m RNA相对表达量与对照组相比无显著差异(p>0.05),IL-4、IL-6和IFN-γm RNA相对表达量分别上调32.4%、35.6%和30.4%(p<0.05);与对照组相比,试验6组脾脏IL-2、IL-4、IL-6和IFN-γm RNA相对表达量分别上调48.9%、41.9%、36.5%和31.3%(p<0.05)。结果表明:1)基础饲粮中单独添加益生菌或高剂量(2.0 g/kg)的辣木叶黄酮可显著提升血清和蛋黄中SOD和GSH-Px活性,当益生菌和辣木叶黄酮联合应用时蛋鸭血清和鸭蛋蛋黄中MDA含量显著降低,SOD和GSH-Px活性显著提升,以试验6组(1.5 g/kg益生菌+1.5 g/kg辣木叶黄酮)效果最佳。2)基础饲粮中单独添加益生菌或高剂量(2.0 g/kg)的辣木叶黄酮可显著提升蛋鸭血清中IgG、IgA、IgM和十二指肠中s IgA含量,当益生菌和辣木叶黄酮联合应用时蛋鸭血清中IgG、IgA、IgM和十二指肠中s IgA含量提升作用更明显,以试验6组(1.5 g/kg益生菌+1.5 g/kg辣木叶黄酮)效果最佳。3)单独添加辣木叶黄酮或益生菌主要刺激蛋鸭上调IL-4基因m RNA在脾脏中的表达,这与血清中IL-4含量检测结果相一致,当辣木叶黄酮和益生菌联合应用时,Th1和Th2型细胞因子的m RNA表达量均有提升,且Th2型细胞因子基因m RNA的表达量总体优于Th1型。4.辣木叶黄酮和益生菌对蛋鸭肠道菌群结构的影响每组随机抽取3只蛋鸭进行解剖,采集蛋鸭盲肠内容物于RNase-Free EP管中并置于干冰内保存,送至上海微基生物科技有限公司进行基因组DNA抽提,用带有标签的特异性引物进行PCR扩增,再用Axy Prep DNA凝胶回收试剂盒回收目的基因,最后进行16S r DNA V4～V5区高通量测序及生物信息学分析。结果显示:对肠道菌群进行OTU聚类分析,共注释到5643个OTU,其中涵盖16个门、24个纲、38个目、62个科、131个属和106个种。在门水平上,主要以拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、梭杆菌门(Fusobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)构成,与对照组相比,试验1组变形菌门显著增加(P<0.05);纲水平上,主要以梭杆菌纲(Fusobacteriia)、拟杆菌纲(Bacteroidia)、Negativicutes和梭菌纲(Clostridia)组成,与对照组相比,T1～T7组梭杆菌纲、拟杆菌纲、Negativicutes和梭菌纲的物种丰度变化与C组相比无显著差异(p>0.05)。目水平上,主要由梭杆菌目(Fusobacteriales)、拟杆菌目(Bacteroidales)、月牙单孢菌目(Selenomonadales)和梭菌目(Clostridiales)组成,T1～T7组梭杆菌目、拟杆菌目、月牙单孢菌目和梭菌目的物种丰度变化与C组相比无显著差异(p>0.05)。科水平上,主要以梭杆菌科(Fusobacteriaceae)、拟杆菌科(Bacteroidaceae)、普雷沃氏科(Prevotellaceae)、酸氨基球菌科(Acidaminococcaceae)、紫单孢菌科(Porphyromonadaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)和瘤胃菌科(Ruminococcaceae)组成,T1～T7组梭杆菌科、拟杆菌科、普雷沃氏科、酸氨基球菌科、理研菌科和瘤胃菌科的物种丰度变化与C组相比无显著差异(p>0.05);与C组相比,T1～T5组紫单孢菌科的物种丰度变化差异不显著(p>0.05),T6和T7组紫单孢菌科的物种丰度变化与对照组相比均增加40%(p<0.05)。属水平上,主要由拟杆菌属(Bacteroides)、梭杆菌属(Fusobacterium)、Parabacteroides、巨单孢菌属(Megamonas)、另枝菌属(Alistipes)和考拉菌属(Phascolarctobacterium)等组成,与对照组相比,T1～T7组拟杆菌属、梭杆菌属、巨单孢菌属的物种丰度无显著差异(p>0.05);试验6和7组Parabacteroides的相对丰度比对照组增加50.0%(p<0.05);试验7组另枝菌属物种相对丰度比对照组高33.3%(p<0.05);试验4组Phascolarctobacterium相对丰度比对照组降低50%(p<0.05);在种水平上,主要以uncultured-bacterium、Bacteroides-barnesiae、Bacteroides-plebeius(平常拟杆菌)、Bacteroides-coprocola、uncultured-organism和Bacteroides-coprophilus组成,其中Bacteroides-plebeius相对丰度与对照组相比显著上升44.4%(P<0.05)。结果表明:蛋鸭基础饲粮中单独添加高剂量(2.0 g/kg)的辣木叶黄酮会导致肠道内考拉杆菌属相对丰度显著降低,表明高剂量的辣木叶黄酮会导致蛋鸭肠道菌群失调,高剂量的辣木叶黄酮和益生菌联合使用后肠道菌群多样性得到改善。结论:蛋鸭基础饲粮中添加辣木叶黄酮和益生菌对蛋鸭的生产性能未产生明显效果;辣木叶黄酮和益生菌联合应用时蛋壳强度显著增强;同时添加辣木叶黄酮和益生菌可显著降低血清和蛋黄中TG、TC、LDL-C含量和显著升高HDL-C含量,并可显著增加蛋鸭抗氧化功能和免疫功能,其中以试验6组(1.5 g/kg益生菌+1.5 g/kg辣木叶黄酮)效果最佳;高剂量(2.0 g/kg)的辣木叶黄酮会导致蛋鸭肠道菌群失调,与益生菌联合使用后肠道菌群多样性得到改善。