目的:文献表明,鸡血藤黄酮类成分以及鞣质类成分对宫颈癌有显著的治疗作用。在以前的研究基础上,采用质谱法分析了鸡血藤黄酮类成分以及鞣质类成分中的主要化学成分,通过超高效液相色谱法分析相关成分的含量,并进一步研究了鸡血藤黄酮类成分以及鞣质类成分在宫颈癌HeLa细胞中的作用机理。本文采用3D微流控芯片模拟体内药效学机制,从而确定合适的给药时间以及给药剂量。在我们的实验结果中显示,鸡血藤黄酮类成分以及鞣质类成分促进了宫颈癌HeLa细胞的凋亡并抑制了细胞增殖。通过对肿瘤基因组图谱（TCGA）和基因表达综合数据库（GEO）的分析,筛选出宫颈癌患者和健康受试者之间差异表达的基因。通过对相关基因的生物信息学分析,结合分子对接技术,预测了与鸡血藤黄酮类成分以及鞣质类成分相互作用的基因和蛋白质。用RT-PCR方法测定了鸡血藤黄酮类成分以及鞣质类成分对相关致病环状RNA（circRNA）的调控作用。上述实验表明,鸡血藤黄酮类成分以及鞣质类成分可以通过作用于宫颈癌HeLa细胞的相关circRNA从而抑制细胞的增殖,并促进细胞凋亡。因此,鸡血藤黄酮类成分以及鞣质类成分可以精确靶向治疗宫颈癌。材料与方法:1.使用安捷伦6550 iFunnel Q-TOF质谱仪进行分析,通过在线数据库和已发表文章的分析,对化合物进行了鉴定。采用超高效液相色谱法进行鸡血藤黄酮类成分以及鞣质类成分指纹图谱的建立以及含量检测。2.在本实验中,利用软光刻技术制作了芯片模型。经过程序化烘烤,制备了3D芯片模型。将聚二甲基硅氧烷（PDMS）和硬化剂以15:1的比例混合并浇铸以形成流体通道层和基质层。将PDMS和硬化剂以8:1的比例混合,然后浇铸形成气体通道层。对流体通道层和气体通道层进行修整和穿孔,并用超净玻璃在氧等离子体中氧化3分钟,然后化学结合形成芯片。3.通过蠕动泵将含有海藻酸钠和含有氯化钙的细胞悬浮液注入芯片,芯片内部形成三维细胞培养环境。培养3天、6天、9天和12天后观察细胞团生长状态。通过蠕动注射泵将含有柠檬酸钠的培养液注入3D芯片。将胶体溶解,收集细胞用于制备细胞涂片。细胞团用Wright Giemsa染色试剂进行染色,以便于观察细胞团生长状态。4.细胞培养12天后给予不同剂量的鸡血藤黄酮类成分以及鞣质类成分和阳性药物。数小时后,用蠕动注射泵采用柠檬酸钠溶液溶解胶体,收集细胞团并制成细胞涂片。采用荧光染料钙蛋白（AM）和碘化丙啶（PI）进行染色,在室温下采用制备的工作液孵育细胞。在荧光倒置显微镜下观察制备的细胞涂片,利用IMAGE PRO PLUS（IPP）软件计算细胞存活率。5.利用流式细胞术分析细胞凋亡和细胞周期,分别加入低、中、高浓度的鸡血藤黄酮类成分以及鞣质类成分和阳性对照药物。36小时后,用膜联蛋白V-FITC细胞凋亡检测试剂盒测定凋亡细胞的百分比,细胞凋亡分析采用流式细胞仪结合FlowJo软件。使用细胞周期分析试剂盒评估鸡血藤黄酮类成分以及鞣质类成分对细胞周期的影响,然后采用流式细胞仪结合ModFit软件分析细胞周期的变化。6.使用TCGA和GEO数据库分析正常人和宫颈癌患者之间的差异表达基因。使用R软件整合表达相同的基因,并由DAVID与KEGG分析。应用遗传算法分析了相关途径中的基因相互作用和核心基因,用STRING分析了与核心基因相关的蛋白质之间的关系,并对靶蛋白进行了分析。7.鸡血藤黄酮类成分以及鞣质类成分可以通过氢键和π-π共轭等作用力与蛋白质中的氨基酸相互作用。对这些化合物的母核进行了筛选,并将对应的母核结构作为分子对接分析的代表性结构。使用AutoDock工具进行分子建模和对接研究,设计并研究了化合物对相关靶蛋白的亲和力。8.使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒和TransStart Top Green qPCR SuperMix试剂盒,将所设计的背对背引物与cDNA结合,对circRNA进行扩增。采用2^-ΔΔCT法对RT-PCR数据进行分析,采用RegRNA分析以circRNA为靶点的miRNA。结果:1.本研究基于UPLC色谱法建立了8个产地的鸡血藤黄酮类成分的指纹图谱,分析表明,不同批次的鸡血藤黄酮类成分指纹图谱与参照图谱相比较,相似度存在一定差异。鸡血藤黄酮类成分中初步鉴定出14种化合物。对其中4种单体进行含量检测,芒柄花苷含量为3.73 mg·g^-1、刺芒柄花素含量为1.63 mg·g^-1、甘草苷含量为5.33 mg·g^-1、大豆苷含量为4.64 mg·g^-1。2.本研究基于UPLC色谱法建立了8个产地的鸡血藤鞣质类成分的指纹图谱,分析表明,不同批次的鸡血藤鞣质类成分指纹图谱与参照图谱相比较,相似度存在一定差异。鸡血藤鞣质类成分中初步鉴定出15种化合物。对3种单体进行含量检测,表没食子儿茶素含量为2.26 mg·g^-1、没食子酸乙酯含量为0.97 mg·g^-1、表儿茶素没食子酸酯含量为1.22mg·g^-1。3.所设计的芯片应用结果证明,该芯片不仅促进了癌细胞团的形成,而且为该药物对人体肿瘤的治疗效果提供了依据。随着时间的增加,不仅细胞数量增加而且细胞团大小也随之增加,将细胞培养12天后细胞团大小达到140μm。因此证明,本实验设计的3D微流控芯片可以模拟人体内细胞团的生长,为筛选给药剂量和给药时间提供依据。4.通过鸡血藤黄酮类成分与鞣质类成分在3D微流控芯片中的作用,证明药物可以有效的抑制细胞增殖并减小细胞团大小。芯片内药物干预实验结果表明,鸡血藤黄酮类成分与鞣质类成分能够通过抑制细胞间相互作用而使细胞团分离和分散。此外,随着剂量的增加细胞的存活率显著降低,对给药时间和给药剂量有明显的依赖性。证明36 h为最佳给药时间,最佳给药浓度分别为0.50 mg·mL^-1、1.00 mg·mL^-1和2.00 mg·mL^-1。5.细胞凋亡分析表明,鸡血藤黄酮类成分与鞣质类成分能显著促进细胞凋亡。随着剂量的增加,细胞凋亡早期和晚期的百分比均显著增加。通过对药物干预的细胞周期的分析结果表明,鸡血藤黄酮类成分通过抑制细胞内DNA的合成,在S期抑制HeLa细胞增殖。鸡血藤鞣质类成分在G₀/G₁期抑制HeLa细胞增殖。6.在生物信息学分析的基础上,根据基因相互作用评分结果,筛选出54个得分较高的基因。对应的蛋白交互作用网络分析表明,该网络包含54个中枢蛋白。所选蛋白可为鸡血藤黄酮类成分与鞣质类成分靶向基因和蛋白质的鉴定提供依据。7.对接分析结果表明,鸡血藤黄酮类成分能与FANCB蛋白、MYBL2蛋白、PRKACB蛋白和PTTG1蛋白结合。鸡血藤鞣质类成分能与ATR蛋白、BLM蛋白、E2F3蛋白和FANCB蛋白结合。结论:1.本研究得到鸡血藤黄酮类成分与鞣质类成分指纹图谱和成分表征,在此基础上对其进行了多指标成分的含量检测。2.该3D芯片可以用于细胞团的培养以及药效筛查研究。3.鸡血藤黄酮类成分与鞣质类成分在一定浓度范围内,均具有诱导细胞凋亡、抑制细胞分裂的作用。4.筛选出的蛋白可以为鉴定鸡血藤黄酮类成分与鞣质类成分靶向的基因和蛋白质提供依据。5.通过分子对接技术筛选出鸡血藤黄酮类成分与鞣质类成分可能作用的基因与蛋白。6.本实验预测鸡血藤黄酮类成分与鞣质类成分通过影响相关的miRNA和circRNA之间的相互作用发挥作用。总之,药物可以通过调节相关的circRNA来抑制HeLa细胞的生长。