目的:研究蒿鳖养阴软坚方合剂抗四氯化碳复合因素所致大鼠肝纤维化的作用,探讨其抗纤维化作用的机制。方法:体内实验:健康Wistar大鼠随机分为7组。正常对照组(n=6)、模型组(n=14)、蒿鳖养阴软坚方低剂量组(n=12)、蒿鳖养阴软坚方中剂量组(n=12)、蒿鳖养阴软坚方高剂量组(n=12)、复方鳖甲软肝片阳性对照组(n=12)、秋水仙碱阳性对照组(n=12)。除正常对照组外,其它各组大鼠第一次皮下注射CCl4植物油溶液(CCl4:花生油=4:6,V/V),0.5ml/100g体重,以后每隔3天皮下注射CCl4植物油溶液0.3ml/100g体重,共注射16次。前2周给予饲料Ⅰ(由80%玉米面+20%猪油+0.5%胆固醇混合制备而成),2周后给予饲料Ⅱ(玉米面+0.5%胆固醇)。自造模当日开始及隔日给予30%的酒精,1ml/只,其余时间饮用洁净自来水。正常对照组大鼠只是注射花生油。治疗组于造模时日起每天给予相应药物。蒿鳖养阴软坚方低剂量组,0.82g/kg/d,1ml/100g;蒿鳖养阴软坚方中剂量组,2.5g/kg/d,1ml/100g;蒿鳖养阴软坚方高剂量组,8.2g/kg/d,1ml/100g。复方鳖甲软肝片组,0.55g/kg/d,1ml/100g;秋水仙碱组,O.1g/kg/d,1m1/100g。正常对照组及模型组给予相同体积的洁净自来水。1.称重法检测大鼠体重、肝重、肝重/体重、脾重、脾重/体重的变化。比色法检测血清MDA含量、ALT活性、AST活性、总蛋白含量、白蛋白含量。2.放射免疫分析法测定血清CIV、PCⅢ、HA及LN水平,比色法检测肝组织羟脯氨酸含量。3.明胶酶谱法检测肝组织基质金属蛋白酶MMP2、MMP9的活性。4.HE染色法、胶原组织染色法观察肝组织的病理变化。免疫组化法检测肝组织α-SMA的表达。5.Real time PCR 法检测 TGF-β1 的表达,Western blotting 法检测 Smad3的表达。细胞培养实验:传代培养HSC-LX02细胞。治疗药物血清的制备:造模完成后于无菌条件下采血制备药物血清。正常药物血清的制备:按半衰期灌胃正常大鼠,共7个半衰期后,采血制备药物血清。1.MTT法观察各处理组对HSC细胞增殖的影响。比色法检测细胞上清液羟脯氨酸含量。2.流氏细胞术检测HSC细胞周期。3.Western blotting法检测HSC细胞中Smad3的表达。结果:体内实验:1.蒿鳖养阴软坚方对CCl4复合因素致大鼠肝纤维化生理生化学的影响。与正常对照组(319.82±56.2g、14.95±10.4g、45.04±26.82)相比,模型组体重、肝及肝/体重下降(234.92±34.13g、8.82±1.12g、37.87±4.37,p<0.01)。与模型组相比,蒿鳖养阴软坚方低、中、高剂量组,体重、肝及肝/体重呈现不同程度的增加(248.02±53.31g、9.14±2.89g、36.22±5.59;243.02±43.91g、9.25±1.76g、38.16±3.74;233.86±53.16g、8.98±1.91g、38.39±5.63),但不及正常对照组。复方鳖甲软肝片对照组及秋水仙碱对照组大鼠也增加(238.97±53.16g、9.46±2.16g、39.52±2.15;264.28±46.56g、9.13±1.44g、34.79±2.89)。与正常对照组(0.64±0.10g、2.01±0.09)相比,模型组脾及脾/体重增加(1.15±0.34g、4.97±1.45,p<0.01)。与模型组相比,蒿鳖养阴软坚方低、中、高剂量组,脾及脾/体重呈现不同程度的降低(1.18±0.39g、4.83±1.48;0.87±0.19g、3.61±0.74,p<0.01;0.72±0.14g、3.07±0.37,p<0.01),但不及正常对照组。复方鳖甲软肝片对照组及秋水仙碱对照组大鼠也降低(1.13±0.33g、4.97±2.20;0.99±0.23g、3.83±0.99)。与正常对照组(7.0±1.0 nmol/ml)相比,模型组MDA含量明显增加(10.4±1.5 nmol/ml,p<0.01)。与模型组相比,蒿鳖养阴软坚方低、中、高剂量组,MDA含量呈现不同程度的降低(9.1±1.7 nmol/ml、8.6±1.6 nmol/ml,p<0.05、7.9±2.0 nmol/ml,p<0.01)。复方鳖甲软肝片对照组及秋水仙碱对照组大鼠也降低(9.1±1.2 nmol/ml、9.1±1.7nmol/ml)。与正常对照组(23.8±8.5卡门氏单位、30.0±11.4卡门氏单位)相比,模型组ALTAST增加(62.0±23.7卡门氏单位,p<0.01、98.8±40.0卡门氏单位,p<0.01)。与模型组相比,蒿鳖养阴软坚方低、中、高剂量组,ALT、AST呈现不同程度的降低(48.8±18.8卡门氏单位、68.8±26.7卡门氏单位,p<0.05;45.3±19.5卡门氏单位,p<0.05、73.3±26.7 卡门氏单位,p<0.05;36.3±9.8 卡门氏单位,p<0.01、50.4±15.6卡门氏单位,p<0.01),但不及正常对照组。复方鳖甲软肝片对照组及秋水仙碱对照组大鼠也降低(50.02±3.7卡门氏单位、57.2±30.0卡门氏单位,p<0.01;46.1±14.8 卡门氏单位、66.0±33.2 卡门氏单位,p<0.05)。与正常对照组(76.9±13.1g/L、36.3±5.2g/L)相比,模型组Tp、Alb降低(45.8±14.8 g/L,p<0.05、24.3±5.3 g/L,p<0.01)。与模型组相比,蒿鳖养阴软坚方低、中、高剂量组,Tp、Alb呈现不同程度的增加(53.2±23.5g/L、28.0±7.4 g/L;58.8±24.9 g/L、30.6±7.5 g/L,p<0.05;67.1±20.2 g/L,p<0.05、33.0±5.6 g/L,p<0.01),但不及正常对照组。复方鳖甲软肝片对照组及秋水仙碱对照组大鼠也增加(60.4±20.2g/L、32.7±7.4g/L,p<0.01;42.7±26.9g/L、31.9±8.3g/L,p<0.05)。2.蒿鳖养阴软坚方对CCl4复合因素所致大鼠肝纤维化基质的影响与正常对照组(0.18±0.13 mg/g干肝重)相比,模型组羟脯氨酸含量增加(2.39±0.28mg/g干肝重,p<0.01)。与模型组相比,蒿鳖养阴软坚方低、中、高剂量组,羟脯氨酸含量呈现不同程度的降低(1.89±0.99 mg/g干肝重、1.29±0.56 mg/g干肝重,p<0.01、1.22±0.45mg/g干肝重,p<0.01),但不及正常对照组。复方鳖甲软肝片对照组及秋水仙碱对照组大鼠也降低(1.77±0.72 mg/g干肝重,P<0.05、2.19±0.66 mg/g 干肝重)。与正常对照组(21.71±1.76ng/ml、15.16±15.12μg/ml、205.30±48.92ng/ml、82.02±8.86 ng/ml)相比,模型组 CIV、PCⅢ、HA 及 LN 含量增加(29.20±6.17 ng/ml、35.73±17.90μg/ml,p<0.01、563.82±335.54ng/ml,p<0.05、89.57±7.59ng/ml)。与模型组相比,蒿鳖养阴软坚方低、中、高剂量组,CIV、PCⅢ、HA及LN含量呈现不同程度的降低(26.38±8.61 ng/ml、27.87±10.13μg/ml、464.19±283.41 ng/ml、79.86±9.52 ng/ml;24.41±4.46 ng/ml、24.72±10.87μg/ml,p<0.05、256.46±95.98 ng/ml,p<0.01、86.34±8.30 ng/ml;26.22±7.97 ng/ml、20.34±13.92μg/ml,p<0.01、161.51±48.29 ng/ml,p<0.01、83.26±13.20 ng/ml),但不及正常对照组。复方鳖甲软肝片对照组及秋水仙碱对照组大鼠也降低(28.02±9.45 ng/ml、30.18±9.4μg/ml、456.18±410.83 ng/m、85.46±7.51 ng/ml;29.22±7.9μg/ml、34.08±9.19 ng/ml、313.17±230.06 ng/ml,p<0.05、88.61±8.97 ng/ml)。与正常对照组(0.46±0.46×108)相比,模型组MMP2的活性增加(1.2±0.57×108,p<0.01)。与模型组相比,蒿鳖养阴软坚方低、中、高剂量组,MMP2 的活性呈现不同程度的降低(0.93±0.47×108、0.65±0.48×108,p<0.05、0.44±0.21×108,p<0.01)。复方鳖甲软肝片对照组及秋水仙碱对照组大鼠MMP2的活性也降低(0.46±0.32×108,p<0.01、0.86±0.58×108)。MMP9 活性较低,各组之间未见差异。3.蒿鳖养阴软坚方对CCl4复合因素所致大鼠肝纤维化组织形态学的影响与正常对照组相比,模型组肝脏组织损伤加重,纤维组织明显增生,肝星状细胞α-SMA表达增加。与模型组比较,蒿鳖养阴软坚方低、中、高剂量组肝脏组织损伤减轻,纤维组织增生减轻,α-SMA表达降低。复方鳖甲软肝片对照组及秋水仙碱对照组肝脏组织损伤减轻,纤维组织增生减轻,α-SMA表达降低。秋水仙碱对照组的疗效不及蒿鳖养阴软坚方中、高剂量组及复方鳖甲软肝片对照组。4.蒿鳖养阴软坚方对四氯化碳复合因素所致肝纤维化大鼠TGF-β1/Smad3信号转导通路的影响与正常对照组相比,模型组TGF-β1表达增加(3.29±2.08倍,p<0.01),蒿鳖养阴软坚方组低、中、高剂量组,TGF-β1表达增加(2.52±1.57倍、2.14±1.42倍、1.68±0.51倍,p<0.05)。复方鳖甲软肝片对照组及秋水仙碱对照组大鼠也增加(2.08±0.57 倍、2.25±0.82 倍)。与正常对照组(0.62±0.08)相比,模型组Smad3表达增加(1.33±0.10,p<0.01)。与模型组相比,蒿鳖养阴软坚方低、中、高剂量组,Smad3表达呈现不同程度的降低(1.20±0.07,p<0.01、1.16±0.05,p<0.01、0.79±0.06,P<0.01),但不及正常对照组。复方鳖甲软肝片对照组及秋水仙碱对照组大鼠也降低(0.95±0.12,p<0.01、1.15±0.06,p<0.01)。细胞培养实验:1.蒿鳖养阴软坚方合剂治疗CCl4致肝纤维化大鼠后所得药物血清对HSC的作用。与正常对照组相比(100%),模型组细胞生存率增加(101.78%)。与模型组相比,蒿鳖养阴软坚方低、中、高剂量组药物血清对HSC细胞的增殖有一定程度的抑制作用,生存率逐渐降低(99.08%、90.29%、85.52%)。复方鳖甲软肝片对照组及秋水仙碱对照组药物血清也有一定程度的抑制作用(89.61%、94.52%)。与正常对照组(2.77±0.20μg/ml)相比,模型组羟脯氨酸含量增加(7.91±0.15μg/ml,p<0.01)。与模型组相比,蒿鳖养阴软坚方低、中、高剂量组药物血清,细胞培养上清液羟脯氨酸含量呈现不同程度的降低(7.52±0.80μg/ml、7.02±0.44μg/ml,p<0.01、6.69±0.26μg/ml,p<0.01),但不及正常对照组。复方鳖甲软肝片对照组及秋水仙碱对照组大鼠也降低(6.84±0.47μg/ml,p<0.01、7.22±0.26μg/ml,p<0.01)。与正常对照组(46.66%、41.67%)相比,模型组G0/G1期降低(34.59%),S期增加(50.93%)。与模型组相比,蒿鳖养阴软坚方低、中剂量组G0/G1期轻度增加(35.89%、36.89%),S期轻度降低(50.39%、49.29%)。蒿鳖养阴软坚方高剂量组能够促进HSC的凋亡(凋亡率为21%)。复方鳖甲软肝片对照组G0/G1期增加(35.03%),S期降低(48.14%),秋水仙碱对照组也能够促进HSC凋亡,凋亡率为(3.91%)。与正常对照组相比,模型组Smad3表达增加。与模型组相比,蒿鳖养阴软坚方低、中、高剂量组,Smad3表达呈现不同程度的降低。2.蒿鳖养阴软坚方灌胃正常大鼠所得药物血清对HSC的作用与正常对照组相比(100%),蒿鳖养阴软坚方低、中、高剂量组药物血清对HSC细胞的增殖有一定程度的抑制作用,细胞生存率逐渐降低(89.46%、81.02%、71.68%)。复方鳖甲软肝片对照组及秋水仙碱对照组药物血清也有一定程度的抑制作用(69.14%、72.01%)。与正常对照组(2.35±0.12μg/ml)相比,蒿鳖养阴软坚方低、中、高剂量组药物血清,细胞培养上清液羟脯氨酸含量呈现不同程度的降低(2.14±0.08μg/ml,p<0.01、1.95±0.11μg/ml,p<0.01、1.77±0.11μg/ml,p<0.01)。复方鳖甲软肝片对照组及秋水仙碱对照组大鼠也降低(1.78±0.06μg/ml,p<0.01、1.91±0.14μg/ml,p<0.01)。与正常对照组(46.7±0.0%、42.1±0.5%)相比,蒿鳖养阴软坚方低、中、高剂量组 G0/G1 期轻度增加(45.6±2.8%、47.2±1.7%、47.7±2.5%),S 期降低(43.1±10.4%、40.0±0.9%、39.4±4.2%)。复方鳖甲软肝片及秋水仙碱对照组G0/G1期增加(52.6±1.2%、45.2±3.6%),S 期降低(34.9±7.9%、43.0±5.9%)。结论:1.蒿鳖养阴软坚方能够改善大鼠一般状况,增加体重、肝及肝/体重,降低脾及脾/体重。降低血清MDA含量、ALT及AST活性。升高总蛋白及白蛋白含量,减轻四氯化碳复合因素造成的肝损伤,改善肝脏功能。2.蒿鳖养阴软坚方能够降低肝组织羟脯氨酸含量及血清CIV、PCⅢ、HA、LN水平,减轻胶原的沉积并能够降低肝组织基质金属蛋白酶MMP2活性,减轻肝损伤。对MMP9的活性影响不明显。3.在组织形态学方面,蒿鳖养阴软坚方能够减轻四氯化碳复合因素造成的肝损伤,降低α-SMA的表达,降低对肝星状细胞的活化作用,减少胶原的沉积,降低肝纤维化程度。4.蒿鳖养阴软坚方能够降低TGF-β1及Smad3的表达,抑制促纤维化TGF-β1/Smad3信号转导通路的激活,降低肝纤维化程度。5.蒿鳖养阴软坚方能够抑制体外培养的HSC细胞的增殖,减少HSC细胞胶原的分泌。还能够抑制HSC细胞周期的转化,抑制细胞的增殖。抑制HSC细胞表达smad3,从而通过作用于细胞周期蛋白而影响细胞周期的转变。