人类γδT细胞具有天然免疫细胞特征，可直接识别某些应激诱导的、细胞表面异常表达的抗原分子并启动γδT细胞的早期活化，在清除病原体和维持机体免疫稳态过程中发挥了重要作用。　　 人MutS同源蛋白2(Human MutS homologue 2，hMSH2)是DNA错配修复系统成员之一，主要在胞浆合成，并在细胞核内发挥DNA损伤的错配修复作用。hMSH2缺陷或表达异常多见于各种肿瘤细胞。本课题组的前期研究发现，hMSH2在正常细胞膜上几乎不表达，而在肿瘤细胞膜表面呈广泛的异位表达。这种膜异位表达能被Epstein-barr病毒(Epstein-barr virus，EBV)感染所诱导。异位表达的hMSH2可为γδT细胞受体（γδT cell receptor,TCRγδ）和NK细胞受体成员2D(Natural killer group 2 member D，NKG2D)双重识别，从而促进γδT细胞对病毒感染细胞的清除。然而，目前hMSH2膜异位表达的调控方式尚不明确。澄清γδT细胞应激性配体分子膜表达的分子机制，将有助于进一步揭示γδT细胞在免疫监视中的重要作用。　　 鉴此，本研究主要针对以下三个科学问题展开：一是hMSH2是否为γδT细胞的应激性配体分子？二是hMSH2应激性膜异位表达的信号调控机制是什么？三是细胞恶变过程中，hMSH2的膜异位表达变化及其对γδT细胞杀伤恶变细胞存在什么影响？本文分两部分就上述三个科学问题进行研究，证实了hMSH2是γδT细胞的应激性配体分子，并发现MAPK家族的p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38-MAPK)通路和应激活化蛋白激酶/c-Jun氨基末端激酶(Stress-activated protein kinase/c-Jun N-terminal kinase，SAPK-JNK)通路是调控hMSH2应激性膜异位表达的重要信号通路，初步揭示了细胞的恶变过程可伴随着hMSH2膜异位表达水平升高的规律性变化。　　 本研究的第一部分包括三项内容。第一项内容旨在证实应激环境中，hMSH2在肿瘤细胞上的膜异位表达是否具有可诱导性。通过建立热应激和氧化应激等细胞应激模型，分析了hMSH2应激时膜异位表达情况。流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测结果表明，hMSH2在肾癌细胞表面呈低水平的组成性表达;应激环境中，hMSH2膜异位表达呈不同程度上调，其中以氧化应激诱导hMSH2膜异位趋势最明显（从8～10％上调至40～50％），而抗氧化剂N.乙酰半胱氨酸（Ⅳ-acetyl-L-cysteine，NAC）能抑制应激诱导的hMSH2膜异位表达（从40～50％下调至6～10％），提示hMSH2的膜异位表达可能被应激环境所诱导。随后，在几种对γδT细胞杀伤作用敏感的血液来源肿瘤细胞（黑素瘤、淋巴瘤和白血病肿瘤）中，证实了hMSH2在肿瘤细胞膜上的异位表达具有可诱导性。运用实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)和免疫印迹技术，发现氧化应激可诱导hMSH2 mRNA及总蛋白表达水平升高，提示氧化应激可能在转录水平上调hMSH2的表达。本研究还发现，hMSH2与γδT细胞经典的应激性配体分子MHC-classⅠ类链相关抗原A/B(MHC-class I chain related A and B，MICA/B)在胞膜的应激性表达上调趋势一致，进一步证实了应激环境中，hMSH2在肿瘤细胞上的膜异位表达具有可诱导性，提示该分子可能为危险相关分子模式(Danger associated molecular pattern，DAMP)家族的成员。　　 本研究第一部分的第二项工作，是利用肾癌细胞建立的氧化应激模型，探讨了hMSH2应激性膜异位表达的信号调控机制。Western blot结果显示，氧化应激时MAPK家族的p38-MAPK、SAPK-JNK和丝裂原活化蛋白／胞外信号调节激酶(Mitogen-activated protein/extracellular signal-regulated kinase，MEK-ERK)通路均处于磷酸化活化状态。利用qRT-PCR、FCM和Western blot技术联合三条信号通路特异性抑制剂，对应激前后hMSH2 mRNA、膜异位和总蛋白表达进行分析，初步证实了p38-MAPK和SAPK-JNK通路主要参与应激时hMSH2膜异位表达的调控，而未见MEK/ERK通路发挥调控作用。进而，当促进p38-MAPK和SAPK-JNK通路上游共同的结点激酶——凋亡信号激酶1(Apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1)活化时，hMSH2在肾癌细胞上的膜异位表达上调，验证了上述两条通路对hMSH2膜异位表达的调节作用。采用qRT-PCR和Wesetern blot方法，发现p38-MAPK和SAPK-JNK通路下游的激活转录因子3(Activating transcription factor 3，ATF3)对氧化应激敏感，且hMSH2调控区存在ATF3的结合位点。运用小RNA干扰（Small interference RNA，siRNA）技术靶向敲低肾癌细胞ATF3表达时，氧化应激诱导的hMSH2膜异位表达水平明显降低，而MICA/B的膜表达变化不明显，提示氧化应激时ATF3对hMSH2膜异位表达的调控作用可能具有特异性。　　 本研究第一部分的第三项内容，旨在进一步确定氧化应激诱导hMSH2膜异位表达中关键的影响因素。运用酶联免疫吸附试验（Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)，证实了氧化应激能促进肾癌细胞自分泌白细胞介素(Interleukin，IL)-18。FCM结果表明，肾癌细胞组成性表达IL-18受体α(Interleukin 18 receptorα，IL-18Rα)，且其表达呈应激性上调。给予肾癌细胞外源性IL-18作用时，hMSH2的膜异位表达上调。利用siRNA技术敲低肾癌细胞IL-18Rα表达时，发现氧化应激诱导肾癌细胞自分泌的IL-18，对hMSH2膜异位表达发挥了直接的促进作用。运用ELISA和胞内免疫荧光染色技术，证实了氧化应激可刺激γδT细胞分泌干扰素(Interferon，IFN).-γ，且外源性IFN-γ可进一步增强hMSH2的应激性膜异位表达。同时，氧化应激、外源性IL-18或IFN-γ作用能有效增强γδT细胞对肾癌细胞的杀伤作用。由此，氧化应激中γδT细胞产生的IFN-7可能上调hMSH2在肿瘤细胞上的膜异位表达，且诱导hMSH2膜异位表达的因素可促进γδT细胞清除肾癌细胞。　　 由于hMSH2的膜异位表达主要存在于上皮及血液来源的肿瘤细胞而非正常细胞表面，因此本研究的第二部分内容，分析了肾正常上皮细胞系HK-2在受到三甲基胆葸（3-methylcholanthrene,3-MCA）诱变时，hMSH2的膜异位表达变化。通过分析HK-2细胞形态和染色体数目，利用刀豆蛋白A(ConcanavalinA，ConA)凝集试验和软琼脂克隆形成试验，证实了3-MCA可诱导HK-2细胞发生一定程度的恶性转变。同时，FCM检测发现hMSH2膜表达出现相应的上调。在诱变后期，hMSH2的膜表达在30～40％，且异位表达的hMSH2促进了γδT细胞对恶变细胞的杀伤。　　 综上，本研究得出以下主要结论：　　 1、应激环境可诱导hMSH2在肿瘤细胞上膜异位表达上调;　　 2、氧化应激时p38-MAPK和SAPK-JNK是调控hMSH2应激性膜异位的重要信号通路;　　 3、氧化应激刺激肾癌细胞自分泌的IL-18和γδT细胞产生的IFN-γ可促进hMSH2在肾癌细胞上膜异位表达，并增强γδT细胞对相应靶细胞的杀伤作用;　　 4、化学诱变引发的细胞恶变过程可伴随着hMSH2膜异位表达上调。　　 本研究的创新点：　　 1、证实γδT细胞配体分子hMSH2具有应激性膜异位表达特征，提示hMSH2可能为DAMP成员，是应激环境中向γδT细胞预警的靶标分子;　　 2、首次报道氧化应激时，p38-MAPK和SAPK-JNK通路为调控hMSH2在肿瘤细胞应激性膜异位表达的重要信号通路，初步揭示了hMSH2膜异位表达的分子调控机制;　　 3、发现氧化应激刺激肾癌细胞自分泌的IL-18及γδT细胞产生的IFN-γ，为促进hMSH2膜异位表达的关键因素，提出ROS联合上述两种细胞因子构成一正反馈回路，维持应激环境中hMSH2在肿瘤细胞上的高水平膜异位表达这一调控模式。　　 本文主要科研成果已在JBC上发表，表明国际学术界对本文的学术结果已有认同。