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伪狂犬病(Pseudorabies)又称奥捷士奇病(Aujeszky’s disease，AD)，是由伪狂犬病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的包括多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。猪是该病毒的自然宿主和贮存者。自1902年发现以来，伪狂犬病已在全球范围内流行，并给全球养猪业造成了巨大的经济损失，成为严重危害养猪业的重大传染病之一。与同属α—疱疹病毒亚科的人单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒和牛疱疹病毒Ⅰ型等一样，PRV具有潜伏感染和神经嗜性等α—疱疹病毒的典型特征。因此，PRV对于研究α—疱疹病毒在自然宿主中的增殖与分布、神经嗜性、致病机理、免疫反应及新型疫苗效力评价等方面具有很大的优越性，颇受疱疹病毒研究学者的青睐，并成为α—疱疹病毒研究的良好模型。 尽管早在上个世纪80年代中期就有学者开始了PRV一些重要功能基因的克隆与序列测定，但由于基因组的G+C含量极高(平均G+C含量为74％)，PRV基因组序列的测定一直进展缓慢。最近几年，随着测序技术的完善和功能基因组研究的迫切需要，各国学者均加强了PRV全基因组序列分析的研究。至2001年，将所报道的不同PRV分离株的序列进行“拼凑”，并与HSV-1基因组进行比较与推测，发现PRV基因组中已有95％左右的序列被测定，仅有3处“缺口”尚未完成，这3处“缺口”可能分别包括UL48—UL49、UL31—UL37和UL15—UL17。毫无疑问，对这些“缺口”进行基因克隆与序列分析，对从整体上研究PRV基因组的结构与功能具有重要意义。 本研究以国内地方分离的PRV Ea株为材料，对两处“缺口”(UL48—UL49和UL15—UL17)进行了基因克隆与序列分析，并对部分基因进行了表达研究，具体研究内容如下： 以UL49.5基因为探针，通过Southern杂交方法获取了包含UL49基因的SalI2.8kb片段，对其中2.0kb的SalI-BamHI片段进行了测序。序列分析结果表明，SalI—BamHI 2.0kb片段全长1959bp，包含UL50部分序列、完整的UL49.5基因以及潜在的UL49基因和UL48基因的部分序列。 根据所测定的UL48基因的部分序列及PRV Ka株UL47基因5’端序列设计引物，通过PCR方法克隆了完整的UL48基因。序列分析结果表明，PRV UL48基因全长1242bp，可编码413个氨基酸，与其它几种α—疱疹病毒UL48基因的同源区段主要集中在中部。结合UL48基因序列以及所测定的SalI—BamHI 2.0kb片段序列，成功拼接了UL48—UL49这一序列未知的“缺口”。 将UL48基因插入原核表达载体pGEX-KG中，构建了GST-UL48融合表达的质粒pGEX-UL48，并在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中实现了高效表达，融合蛋白分子华中农业大学2004届硕士学位论文量约为65kD。进一步构建了UL48基因的真核表达质粒pcDNA一UL48，脂质体介导转染Hela细胞，W七stem Blot检测发现:表达UL48基因的Hela细胞在38kD和50一60kD处出现几条特异性条带，证实UL48基因在Hela细胞中得到了表达，并且有可能同细胞中成分相结合。为了进一步研究UL48在细胞中的定位，构建了EGFP一UL48融合表达的真核表达质粒pEGFP一UL48，转染Hela细胞后的荧光观察表明UL48在Hela细胞中呈现出多种定位方式。 通过PCR方法克隆了完整的UL49基因，并将UL49基因插入到原核表达载体pET-28a中，在大肠杆菌中实现了高效表达，表达产物为37kD。构建了UL49与mut4EGFP融合的真核表达质粒peDNA一UL49一M4，脂质体介导转染Hela细胞后的荧光观察显示:UL49在Hela细胞中也呈多种定位方式，但主要以颗粒样分布在核或核外周。 为了进一步拼接UL 15一 UL17区段的“缺口”，通过酶切方法克隆了PRV BamHI一3、BamHI一4片段，并通过酶切方法分段测序，获得了PRV UL13一UL17基因完整编码区序列。序列分析发现:UL16、U17基因位于UL巧基因内部，并可能是UL15基因的内含子序列。通过预测软件初步确定了可能的切割位点，并在切割位点的两端设计了一对引物，从PRV感染的PK一15细胞中进行RT-PCR扩增，扩增产物的序列测定结果表明:UL巧基因是一个剪接型基因，由两段外显子构成，其内含子包括1120一4004位的碱基，UL巧剪接位点的供体和受体序列与哺乳动物典型的序列有很高的同源性。根据UL 1 5 eDNA序列推导出讥15编码751个氨基酸，0292K293T29‘、n38，E386为其潜在的Wa玫er boxA和B。 通过PCR方法克隆了PRV UL14基因，构建了GST-UL14融合的原核表达质粒pGEX一UL14，在大肠杆菌BLZI口E3)P lyss中实现了高效表达，融合蛋白分子量为44kD，并主要以不溶性包涵体形式存在。 本研究对包含PRV UL49基因的撇月2.skb片段、BamHI一3及BamHI一4的克隆与测序，成功地获得了UL48一UL49、UL13一UL17的完整序列，缩小了PRV基因组的“缺口”，为从整体上研究PRV基因组的结构与功能提供了可能。同时，UL48、UL49、UL14等基因的克隆与表达及UL15剪接位点的确定，为进一步研究这些基因的功能奠定了基础。