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名贵中药材石斛药用历史悠久,具有强阴益精,补肾益力,明目和延年益寿等作用。由于石斛类药材长期过量采挖,造成资源紧缺,商品干药材来源十分复杂。除了40多种常用的药用石斛外,还常混杂石仙桃属、石豆兰属等植物,影响了商品药材的质量。因此建立准确可靠的商品药材的鉴定方法具有重要的意义。
本研究首次报道了商品类干药材的DNA提取方法、序列鉴定、斑点杂交鉴定及常用种球花石斛、鼓槌石斛、翅萼石斛的位点特异性鉴别研究结果:
1.DNA提取方法的考察:首先考察了试剂盒和经典CTAB法及其2种改进法对提取DNA的影响,确定了经典CTAB法为提取方法对采集常用于加工成商品药材的新鲜材料31个样本材料进行了DNA的提取。并同时考察了不同干燥条件对DNA提取的影响,结果表明,不同干燥条件可以得到较完整DNA片段。以经典CTAB法均提取得到了22批商品类石斛干药材DNA。
2.商品类干药材的ITS序列测定:对提取得到的22批商品类石斛干药材的DNA进行ITS序列扩增,克隆测序,得到的序列与GenBank收录ITS序列比对,得到92个基源种,12批黄草类商品石斛干药材的测序结果得到黄石斛、球花石斛、金钗石斛、反瓣石斛、叠鞘石斛、短棒石斛、矩唇石斛、束花石斛、剑叶石斛9个种类;10批枫斗类商品石斛干药材测序结果得到黄石斛、串珠石斛、肿节石斛、束花石斛、铁皮石斛、D.sinuatum共6个种类,均为文献报道加工成商品石斛的常用种。该鉴定方法具有较高的准确性。
3.商品类干药材的斑点杂交鉴定:将已知4种石斛混合作探针,考察斑点杂交条件,初步确定以含0.5×SSC的初级洗膜液、洗膜1次(10min,80mL)、2.5ng的探针量为杂交条件。分别选取商品类黄草石斛材料1和枫斗石斛材料7进行斑点杂交鉴定,黄草类石斛材料1鉴定出黄石斛、球花石斛、金钗石斛、竹枝石斛、长苏石斛、玫瑰石斛、流苏石斛、晶帽石斛、反瓣石斛、杯鞘石斛、鼓槌石斛、线叶石斛、束花石斛、黑毛石斛、叠鞘石斛、翅萼石斛共16个种。枫斗类石斛材料7鉴定出黄石斛、束花石斛、铁皮石斛、竹枝石斛、长苏石斛、铜皮石斛共6个种,这些石斛亦为加工成枫斗类石斛的常用种,该方法具有方便、快捷、省时等优点。
4.球花石斛、鼓槌石斛、翅萼石斛的位点特异性鉴别研究:通过对GenBank上登陆的164种石斛rDNAITS序列比对分析,设计了3对鉴别引物QH-JB1与QH-JB2、GCh-JB1与GCh-JB2、ChE-JB1与ChE-JB2,并分别建立了上述3种石斛的特异性条件。将建立的球花石斛的位点特异性鉴别方法初步运用到3批黄草石斛药材鉴别,鉴定得到了球花石斛。此法与形态学、DNA测序等鉴别方法相比,具有高效、准确、简便、省时等优点。