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S02(sulfur dioxide, SO2)是一种广泛存在的大气污染物,环境中较高浓度的SO2对人类、动物和植物均具有毒性作用。SO2对生物的危害主要是通过它进入生物体内后产生的代谢物-亚硫酸钠与亚硫酸氢钠对生物组织、细胞和生物大分子的作用来实现的。S02及其体内衍生物可以显著抑制细胞分裂,诱发遗传损伤,使根尖中具有微核、染色体畸变的细胞数明显增加,出现细胞固缩和死亡。SO2胁迫能引起植物组织活性氧(ROS)增加,诱导抗氧化酶基因和防护基因的表达。研究发现,SO2胁迫能引起蚕豆、拟南芥保卫细胞ROS水平增高,ROS可激活细胞质膜钙通道,进而引起胞内Ca2+增加,介导细胞死亡。但目前为止,关于S02对微生物毒性效应的研究报道很少。酵母是一种研究真核生物细胞学机制的模式生物,具有生长周期短,易于培养,遗传背景简单等特征,已被广泛用于细胞分裂和死亡等的研究。研究表明,环境理化因素如UV-B、高渗透压、过氧化氢(H202)和NaCl等均可诱导酵母细胞凋亡本文根据SO2进入生物体后以它的衍生物-亚硫酸钠和亚硫酸氢钠(3：1,mmo1·L-1)的形式对细胞产生危害的事实,研究SO2诱导的酵母细胞凋亡效应及其途径,为揭示SO2毒性作用的分子机理提供实验依据。研究发现,一定浓度的SO2衍生物可诱导酵母细胞凋亡,ROS、Ca2+及类caspase蛋白酶参与了SO2诱导的细胞凋亡,并发挥了重要作用。主要实验结果如下：1.浓度20~100mmol·L-1的SO2衍生物处理酵母细胞3-24h后,细胞活性降低,部分细胞死亡；随着处理浓度的提高和作用时间的延长,细胞死亡率逐渐增高。利用ROS荧光指示剂DCFH-DA、Ca2+荧光指示剂Fluo-3AM及NO荧光指示剂DAF-FM DA检测胞内ROS、Ca2+和NO水平,发现SO2处理可诱导酵母细胞内ROS和Ca2+水平升高,但NO水平无显著变化。2.一定浓度的抗氧化剂抗坏血酸(AsA,1mmol·L-1)、Ca2+螯合剂乙二醇双四乙酸(EGTA,0.5mmo1·L-1)与SO2衍生物共同作用时,细胞死亡率显著降低。3.用2μmol·L-1泛caspase蛋白酶抑制剂Z-Asp-CH2-DCB与S02衍生物同时作用时,SO2衍生物诱导的细胞死亡率显著降低,说明S02诱导的酵母细胞死亡过程中存在依赖于caspase途径的细胞凋亡途径。4.用25mmo1·L-1和50mmo1·L-1SO2衍生物处理3-24h后,转凋亡抑制基因Bcl-2,Ced-9的酵母菌细胞死亡率显著低于对照菌(转空载体),说明SO2诱导的酵母细胞死亡可被Bcl-2和Ced-9调控。1mmol·L-1As A能显著降低100mmol·L-1SO2衍生物诱导的转Ced-9酵母细胞的死亡,而对转Bcl-2的酵母菌无明显的缓解作用。0.5mmol·L-1EGTA能有效降低100mmol·L-1SO2衍生物诱导的转Ced-9和转Bcl-2酵母菌细胞的死亡。5.用50mmol·L-1的SO2衍生物处理可诱导酵母细胞线粒体膜电位(Δψm)下降,50-100mmol·L-1的SO2衍生物处理后,转基因菌及对照菌细胞胞质中细胞色素c(cyt c)含量升高,转基因菌cyt c含量低于对照菌。研究结果表明,高浓度的S02衍生物可诱导酵母细胞死亡,死亡过程与胞内ROS水平增高有关,ROS能激活质膜Ca2+通道,使胞外Ca2+内流,造成胞内Ca2+浓度升高,激活钙信号系统。Caspase抑制剂和凋亡抑制基因Bcl-2和Ced-9均可以显著降低S02衍生物引起的细胞死亡率,说明S02诱导的酵母细胞死亡途径中细胞发生了程序性死亡。SO2胁迫期间,酵母细胞内ROS和Ca2+水平显著升高,线粒体膜通透性增加,Δψm下降,cyt c释放,进而激活下游的caspase途径,引起细胞凋亡。