第一章超排卵周期和自然周期中未成熟卵母细胞的体外成熟培养目的：在传统辅助生殖(assisted reproductive technique, ART)治疗过程中,患者经控制性超排卵周期往往可获得大量卵母细胞,但在这些卵母细胞中有15%由于未成熟而无法受精,最终这些未成熟卵母细胞多将被抛弃。本研究对ART治疗中控制性超排卵周期和自然周期中所得到的未成熟卵母细胞进行未成熟卵母细胞体外成熟(in vitro maturation, IVM),并对培养成熟后的卵母细胞进行卵胞浆内单精子注射(intracytoplasmic sperm injection, ICSI),然后观察其受精、胚胎发育及临床妊娠情况,目的在于评估这些未成熟卵母细胞的临床应用价值,提高卵母细胞利用率。材料和方法：1.材料来源：本研究资料筛选了2010年1月至2014年12月广州南方医科大学南方医院妇产科生殖医学中心实施未成熟卵母细胞体外培养的患者。共计109个周期。其中64例为长方案促排卵ICSI周期,共获得248个不成熟卵母细胞,45例来自于自然周期,共获得45个未成熟卵母细胞。根据未成熟卵母细胞来源分为超排卵组和自然周期组。2.方法：患者于前一月经周期黄体中期开始使用促性腺素释放激素(gonadotropin-releasing hormone agonists, GnRHa)予以降调节,于降调后14-15天来院抽血查E2、P、LH的水平及行B超检查,确定是否达到降调效果,如达到则加用促性腺激素(gonadotropin, Gn),根据B超监测及血清激素的水平调整Gn用量,当≥18mm卵泡有2个以上时,当晚给予人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin hormone, HCG)10000IU,注射后36小时在B超引导下穿刺取卵。将收集的卵母细胞在37℃、6%CO2及饱和湿度条件下培养4-6小时,然后在80IU/ml的透明质酸酶作用下去除颗粒细胞,将有第一极体的成熟卵母细胞进行常规卵胞浆内单精子注射(ICSI),剩余未成熟卵母细胞(MI期和GV期)在常规G-IVF plus培养液中37"C、6%C02及饱和湿度条件下培养24-30小时。将培养成熟的卵母细胞(MII期)进行常规ICSI授精并放于G1-plus培养液中37℃、6%C02及饱和湿度条件下培养16-18小时后观察受精情况,将有明显2PN的正常受精胚胎继续胚胎培养,并于受精后24小时和48小时对胚胎进行胚胎质量评估。选取质量最优胚胎进行第三天常规胚胎移植,剩余胚胎进行常规冷冻。移植后12天检测血β-HCG,若妊娠,在胚胎移植后4周行超声检查,若出现妊娠囊,则确定为临床妊娠。对成熟率、受精率、优良胚胎率和临床妊娠情况进行统计比较。结果：超排卵组患者平均年龄34.48±5.7,自然周期组患者平均年龄36.29±7.2,组间差异无统计学意义(P>0.05)。超排卵组共有248个未成熟卵母细胞进行了IVM,最终成熟163个；自然周期组共有45个未成熟卵母细胞进行了IVM,最终成熟43个。两组成熟率分别为超排卵组65.73%、自然周期组95.56%,组间差异有统计学意义(P<0.05)。在对两组成熟卵母细胞ICSI授精后,超排卵组共有105个卵母细胞受精,受精率为64.42%、自然周期组共有33个卵母细胞受精,受精率为76.74%;正常受精胚胎培养24小时后超排卵组有80个胚胎卵裂,卵裂率为89.89%、自然周期组共有27个胚胎卵裂,卵裂率为100%；培养至第三天超排卵组共形成14个优良胚胎,优良胚胎率17.50%、自然周期组形成9个优良胚胎,优良胚胎率为33.33%。两组在受精率、卵裂率及优良胚胎率方面的差异均无统计学意义(P>0.05)。超排卵组共进行了25例移植,没有获得妊娠；自然周期组共进行了19例移植,妊娠5例,两组间妊娠率分别为超排卵组0%、自然周期组26.32%,组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论：1.自然周期所获得的未成熟卵母细胞在通过IVM培养、ICSI授精后可以得到形态学上优质的胚胎,通过移植后能实现患者妊娠,有较好的临床应用价值。2.超排卵周期中的未成熟卵母细胞在通过IVM培养、ICSI授精后可以得到形态学上优质的胚胎。第二章超排卵周期中体外成熟卵母细胞的玻璃化冷冻目的：在传统辅助生殖(ART)治疗过程中,患者经控制性超排卵周期往往可获得大量卵母细胞,但在这些卵母细胞中大约有15%由于未成熟而无法受精,最终这些未成熟卵母细胞多将被抛弃。本研究对ART治疗中控制性超排卵周期中剩余的未成熟卵母细胞进行体外成熟培养(IVM),然后对培养成熟的卵母细胞进行玻璃化冷冻复苏并行ICSI授精,将其受精及胚胎发育情况与未经玻璃化冷冻复苏的体外成熟卵母细胞比较,目的在于研究体外成熟卵母细胞的玻璃化冷冻保存和复苏,以及受精、胚胎发育情况,并进一步探讨未成熟卵母细胞再利用的可行性。材料和方法：1.材料来源：IVM冷冻组材料收集自2014年1月到2014年12月在广州南方医科大学南方医院生殖医学中心进行长方案促排卵ICSI周期的不孕患者所剩余的废弃未成熟卵母细胞,共收集92个未成熟卵母细胞,其中包括GV期卵母细胞51个,MI期卵母细胞41个。IVM组资料筛选了2010年1月至2014年12月广州南方医科大学南方医院妇产科生殖医学中心实施未成熟卵母细胞体外培养的患者。共64个长方案促排卵ICSI周期,获得248个未成熟卵母细胞。2.方法：将收集的未成熟卵母细胞(MI期和GV期)在G2-plus囊胚培养液中37-C、6%C02及饱和湿度条件下培养24-30小时,收集有极体排出的成熟卵母细胞(MII期)。1)玻璃化冷冻：将成熟卵母细胞1-2个(不超过3个)用煅烧拉细的巴氏吸管移入ES液中5-15分钟,观察其体积变化情况,当卵母细胞皱缩后又恢复到原体积时将其移入VS液中。在VS液中不同的位置吹吸卵母细胞3次以上,然后将卵母细胞和尽量少的VS液放到Cryotop载体尖端,并迅速投入液氮,把载体放入冷冻支架,投入液氮罐提桶中保存。2)玻璃化复苏：把要解冻的载体从液氮罐中取出,将载体尖端迅速放入TS液中,在解剖显微镜下找到载体尖端上的卵母细胞,并轻微抖动,使卵母细胞滑入TS液内。卵母细胞在TS液中停留1分钟。用煅烧拉细的巴氏吸管将卵母细胞转移到DS液中停留3分钟,然后移入WS1和WS2液中各停留5分钟,最后将卵母细胞放入装有G-IVF plus的小皿中,显微镜下观察卵母细胞存活情况,在37℃、6%CO2及饱和湿度培养箱内培养。3)授精及胚胎培养：解冻复苏后的卵母细胞在G-IVF plus培养液中继续培养2小时并进行ICSI授精,授精后将其放于G1-plus培养液中37℃、6%CO2及饱和湿度条件下培养16-18小时后观察受精情况,将有明显2PN的正常受精胚胎继续胚胎培养,并于受精后24小时和48小时对胚胎进行胚胎质量评估。结果：IVM组患者平均年龄34.48±5.7,IVM冷冻组患者平均年龄32.00±4.2,组间差异没有统计学意义(P>0.05)。IVM组共有248个未成熟卵母细胞进行了IVM,最终成熟163个,成熟率为65.73%;IVM冷冻组共有92个未成熟卵母细胞行IVM培养,成熟78个,成熟率为84.78%。两组间成熟率差异有统计学意义(P<0.05)。IVM冷冻组共有92个未成熟卵母细胞,其中GV期卵母细胞51个,IVM成熟38个,成熟率74.51%；MI期卵母细胞41个,IVM成熟40个,成熟率97.56%,GV组和MI组成熟率组间差异有统计学意义(P<0.05)。IVM冷冻组共冷冻78个成熟卵母细胞,复苏存活63个,复苏率80.77%；其中来源于GV期的成熟卵母细胞35个,复苏存活30个,复苏率85.71%；来源于MI期的成熟卵母细胞43个,复苏存活33个,复苏率76.74%。GV组与MI组复苏率差异没有统计学意义(P>0.05)。IVM组和IVM冷冻组培养成熟后的卵母细胞经ICSI授精后其受精率、卵裂率、优良胚胎率分别为IVM组64.42%(105/163)、89.89%(80/89)、17.50%(14/80)；IVM冷冻组77.78%(49/63)、91.11%(41/45)、21.95%(9/41),IVM组和IVM冷冻组受精率、卵裂率、优良胚胎率组间差异没有统计学意义(P>0.05)。IVM冷冻组复苏的卵母细胞中来源于GV期的成熟卵母细胞共30个,其受精率、卵裂率、优良胚胎率分别为73.33%(22/30)、90.90%(20/22)、15.00%(3/20)；来源于MI期的成熟卵母细胞共33个,其受精率、卵裂率、优良胚胎率分别为81.82%(27/33)、91.30%(21/23)、28.57%(6/21),GV组和MI组受精率、卵裂率、优良胚胎率组间差异没有统计学意义(P>0.05)。结论：1.未成熟卵母细胞能在G2-plus囊胚培养液中发育成熟。2.在超排卵周期中剩余的未成熟卵母细胞在体外培养成熟经玻璃化冷冻复苏后,能进一步受精并发育成形态上优质的胚胎。