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目的:1.探讨密度梯度离心法分离胃癌患者外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)的优化条件,为细胞分离提供质量保证。2.利用数学模型,分析薄芝糖肽浓度、细胞培养时间、是否为胃癌患者的对象类别共3个因素对PBMCs增殖的影响,初步明确薄芝糖肽调节胃癌患者PBMCs增殖的可能性。3.探索薄芝糖肽对胃癌患者PBMCs增殖调节的规律。4.明确薄芝糖肽对胃癌患者PBMCs分泌抑制性细胞因子白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)的影响。方法:1.用JMP 10.0软件的定制实验设计模块,以离心时间、离心速度为因子变量,离心所得PBMCs的厚度值为响应变量,定义因子约束,添加因子的交互效应及二次效应,按照定制设计的离心时间和速度组合条件,使用Filcoll淋巴细胞分离液分离PBMCs,数码相机拍摄离心管中的细胞分层,Photoshop CS 6软件测量PBMCs层的厚度,JMP软件最小二乘法分析、最大化意愿因子刻画获得最佳离心条件,验证离心,测量PBMCs厚度值,台盼蓝染色,计算细胞存活率。2.用JMP 10.0软件定制设计方法,以药物浓度(mg/L),培养时间(h),对象类别(研究对象的分类水平为:胃癌患者、非胃癌患者)作为因子变量,PBMCs的吸光度值(OD)作为响应变量,对药物浓度、培养时间2个连续变量进行因子约束,根据定制设计条件进行MTT检测,测定不同条件组合模式对应的PBMCs的OD值,建立数学模型,标准最小二乘法进行效应筛选,进行拟合模型分析。3.采用重复测量数据的分差分析方法,根据薄芝糖肽浓度分为6组(0 mg/L即对照组,25 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L、200 mg/L药物干预组),分别作用于胃癌患者的PBMCs,分别培养4小时、12小时、24小时、48小时,MTT法测定OD值,JMP 10.0软件分析结果。4.分4组干预胃癌患者PBMCs(16小时),薄芝糖肽的每组终浓度分别为0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L,ELISA法测定IL-10含量。结果:1.PBMCs离心条件优化模型的F值为8.911,P<0.01,决定系数(R2)为0.88。离心速度与离心时间的交互作用对PBMCs厚度的影响无统计学意义(P>0.05),离心时间及其二次效应、离心速度及其二次效应对PBMCs厚度的影响均具有统计学意义(P<0.05)。拟合模型因子刻画的曲面图显示:离心时间、离心速度与离心厚度呈现较为复杂的曲线关系,而非简单的线性关联。最优离心条件为:离心时间=10 min,离心速度=2307 r/min。优化条件下分离PBMCs,台盼蓝染色,计算细胞存活率平均为95%。2.薄芝糖肽浓度与细胞培养时间的交互作用对PBMCs的增殖影响具有统计学意义,P<0.05。药物浓度对增殖的影响具有统计学意义,P<0.01。培养时间主效应的P=0.055,对象类别的主效应、与时间和浓度的交互效应均无统计学意义(P>0.05)。等高线图显示时间因素的作用较小。因子轨迹线显示浓度因子的陡峭程度明显高于培养时间、对象类别。最大化意愿刻画的薄芝糖肽浓度为196 mg/L、培养时间为4 h、对象类别为胃癌患者,OD值为0.354308,95%CI(0.30289,0.40573)。3.重复测量数据方差分析模型的Mauchly准则为0.781,P<0.01;时间、浓度的交互作用校正P值<0.01。对象内效应(时间)的F值为286.077,P值为2.553E-43,一元的G-G Epsilon、一元的H-F Epsilon校正检验显示,对象内效应的差异具有统计学意义(P<0.01)。对象间效应(浓度)的F值为192.390,P值为1.894E-44。4个时间点内部,与对照组比较,不同浓度的薄芝糖肽均可促进胃癌患者PBMCs的增殖(P<0.05)。4.0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L组的IL-10浓度(`x±s,pg/ml)分别为:(5.36±0.46)、(6.73±0.25)、(9.23±0.77)、(12.35±0.86)。单因素方差分析得出:50 mg/L组与对照组对比,P<0.05;100 mg/L、200 mg/L组分别与对照组对比,P<0.01;100 mg/L组、200 mg/L组分别与50 mg/L组比较,P<0.01;200 mg/L组与100 mg/L组比较,P<0.01。结论:1.JMP定制实验设计方案可以优化胃癌患者PBMCs的离心分离条件,数学模型分析结果可以进一步进行最大化意愿刻画,获得最佳的分离参数值,验证离心显示PBMCs存活率较高。2.薄芝糖肽浓度、培养时间、对象类别(胃癌和非胃癌患者)的多因子模型中,浓度对PBMCs的增殖发挥影响。胃癌患者的PBMCs对薄芝糖肽的促增殖反应与非胃癌患者无显著性差异,存在使用薄芝糖肽调节胃癌患者PBMCs增殖的基础。3.薄芝糖肽浓度依赖性和时间依赖性地促进胃癌患者PBMCs的增殖。4.薄芝糖肽促进胃癌患者PBMCs分泌IL-10。