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辣椒疫霉和香蕉枯萎镰刀菌4号小种是热带地区重要的植物土传病害病原菌,目前尚无有效的生物农药进行防治。五指山是海南最大的国家自然保护区,也是世界上现存地势最高的原始热带雨林之一,蕴藏着极其丰富的放线菌资源。本研究从前期分离获得的1261株放线菌中随机挑选了511株放线菌进行了抗辣椒疫霉菌和香蕉枯萎病菌的活性评价,并从中挑选出1株对辣椒疫霉和香蕉枯萎病均有较高拮抗活性的菌株WZ254进行了抗生素的分离纯化,其主要研究结果如下:
一、以香蕉枯萎病菌4号小种和辣椒疫霉菌为抑制对象,通过平板对峙培养法对511株放线菌的抑菌活性进行了初步测定,筛选出对辣椒疫霉菌具强抑菌活性的菌株8株:WZ41、WZ159、WZ184、WZ254、WZ391、WZ420、WZ423和WZ428,其抑菌距离分别是18mm、18mm、16mm、20mm、16mm、17mm、18mm、17mm,具较强抑菌活性的菌株6株:WZ142、WZ149、WZ227、WZ232、WZ235、WZ258、WZ342、WZ349、WZ396、WZ411,其抑菌距离分别是12mm、11mm、13mm、12mm、13mm、13.5mm、10mm、14mm、11mm、10mm;筛选出对香蕉枯萎病菌4号小种具较强抑菌活性的菌株4株:WZ235、WZ254、WZ342、WZ423,其抑菌距离分别是13.5mm、13mm、11mm、10.5mm。
二、对筛选出的对辣椒疫霉菌和香蕉枯萎病菌有活性放线菌在五指山的分布进行初步统计分析,发现对两种病菌均有活性的放线菌约有2/3都分布在样路线Ⅲ的土壤样本中(沿着山路,在山路的两边约10~20m处采样),且对辣椒疫霉有活性的放线菌约有1/2分布在海拔高度1000m以下,对香蕉枯萎病菌有活性的放线菌约有1/2分布在海拔高度1000m以下。
三、选取对辣椒疫霉菌和香蕉枯萎病菌都有强抑菌活性的WZ254菌株进行了抗生素的分离纯化。WZ254发酵液上清发酵液经减压浓缩后得到的粘稠膏状物,为黑褐色,糖浆味,经乙酸乙酯萃取后,其水相和脂相均对辣椒疫霉病菌有活性,但对香蕉枯萎病菌均没有活性。经硅胶层析和结晶法相结合分离获得了一个主成分纯化合物,经与标准品进行TLC对照,与已知抗生素-丰加霉素一致,取1mg稀释成1mg/mL的浓度做辣椒疫霉病菌的抑菌活性,对辣椒疫霉具有极强的抑菌活性。
四、对WZ254菌株进行了形态观察,WZ254的气生菌丝体灰白色,基内菌丝体无色,孢子丝呈开螺旋卷曲。
五、对WZ254菌株的生理生化特征测定,结果表明,WZ254菌株能产生蛋白酶使明胶液化;能使硝酸盐还原;能产生淀粉酶使淀粉水解;能利用尿素:不产生纤维素酶;不产生H2S;不能产生凝乳酶使脱脂牛奶凝固,而产生蛋白酶使脱脂牛奶胨化;不能在酪氨酸培养基上产生黑色素。
六、对WZ254菌株进行了16SrDNA测序分析。结果表明,WZ254菌株与链霉菌属的系列一致性达99%,说明WZ254菌株属于链霉菌属。根据WZ254菌株的形态特征、生理生化特性和16SrDNA测序分析结果,WZ254菌株与白刺链霉菌和原绛红链霉菌同源性最高,但究竟是哪一个种,仍需进一步鉴定。
七、对WZ254发酵液的稳定性进行了研究,结果表明,WZ254发酵液在80℃加热1h、pH2至pH12处理24h、常温下贮存6个月、紫外线辐射2h及在自然光照8h等条件下,其抑菌活性保持稳定,符合农用抗生素的稳定性要求。