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目的:通过收集难治性根尖周炎临床样本以及建立细胞水平的炎症微环境,研究Btk在难治性根尖周炎中的表达以及作用机制,探讨其与难治性根尖周炎骨破坏之间的潜在关系。方法:1、临床样本的全基因体表达谱芯片筛选及结果验证比对5例难治性根尖周炎组织和5例健康根尖周组织的全基因体表达谱芯片,筛选差异基因,通过Real-Time PCR和Western Blot对其中差异基因Btk的表达情况进行验证。2、诱导RAW264.7细胞分化成破骨细胞选择10%FBS的DMEM培养基将RAW264.7细胞培养至第三代,用0.1ug/ml RANKL诱导液进行诱导,分别用倒置相差显微镜和TRAP染色观察细胞形态。3、粪肠球菌LTA介导炎症微环境下,Btk在破骨细胞中的表达用粪肠球菌LTA作用于诱导后的RAW264.7细胞,分别在0、24和48小时采用CCK8法检测破骨细胞增殖情况,并用Real-Time PCR和Western Blot分别检测Btk以及破骨细胞标志因子CTSK和TRAP的表达情况。用免疫荧光法检测Btk在破骨细胞中的定位情况。4、转染Btk使其低表达,研究破骨细胞的增殖及标志因子的表达情况粪肠球菌LTA作用于破骨细胞后,转染Btk使其低表达,通过CCK8法检测破骨细胞的增殖情况,并分别用Real-Time PCR和Western Blot检测破骨细胞标志因子CTSK和TRAP的表达情况。5、加入人重组蛋白Btk使其高表达,研究破骨细胞的增殖及标志因子的表达情况粪肠球菌LTA作用于破骨细胞后,加入人重组蛋白Btk使其高表达,通过CCK8法检测破骨细胞的增殖情况,并分别用Real-Time PCR和Western Blot检测破骨细胞标志因子CTSK和TRAP的表达情况。结果:1、临床样本的全基因体表达谱芯片筛选及结果验证通过全基因体表达谱芯片结果分析发现5例临床标本中均存在显著差异表达的基因共1787个,其中上调的1156个,下调的631个。其中在难治性根尖周炎中Btk较正常对照组高表达,且有显著差异(P<0.001)。临床样本验证,Real-Time PCR检测发现Btk在难治性根尖周炎中的m RNA较对照组表达高(P<0.05),Western Blot检测发现在难治性根尖周炎中Btk的蛋白水平较对照组高,此结果与芯片筛选结果相一致。2、诱导RAW264.7细胞分化成为破骨细胞加入RANKL诱导液5天后,通过光学显微镜和TRAP染色观察发现RAW264.7细胞成功诱导为破骨细胞。3、粪肠球菌LTA介导炎症微环境下,Btk在破骨细胞中的表达CCK8结果显示粪肠球菌LTA作用于破骨细胞后在24小时和48小时的增殖速率较正常对照组高(P<0.05)。Real-Time PCR结果显示实验组中Btk以及破骨分化标志因子CTSK和TRAP的m RNA水平增高,差异有统计学意义(P<0.05)。Western Blot结果显示Btk以及破骨分化标志因子CTSK和TRAP的蛋白水平的表达情况与Real-Time PCR结果相一致。免疫荧光检测发现正常细胞内,Btk表达在胞浆中,而在LTA作用后Btk则表达在胞浆和胞核中。4、转染Btk使其低表达,研究破骨细胞的增殖及标志因子的表达情况CCK8结果显示si-Btk组的破骨细胞在24小时和48小时的增殖速率均比对照组降低,且差异有统计学意义(P<0.05)。Real-Time PCR结果显示破骨标志因子CTSK和TRAP的m RNA水平si-Btk组较对照组低(P<0.05)。Western Blot结果显示CTSK和TRAP蛋白水平的表达情况与Real-Time PCR结果相一致。5、加入人重组蛋白Btk使其高表达,研究破骨细胞的增殖及标志因子的表达情况CCK8结果显示rh-Btk组的破骨细胞在24小时和48小时的增殖较对照组高,且差异具有统计学意义(P<0.05)。Western Blot结果发现破骨分化标志因子CTSK和TRAP的蛋白水平表达rh-Btk组较对照组升高。结论:Btk在难治性根尖周炎的骨破坏中发挥一定作用。在粪肠球菌LTA介导的炎症微环境下,Btk可以促进破骨细胞增殖及骨破坏标志因子的表达。