【摘 要】
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群体感应是微生物调节调控群体生理代谢活动的一种极为重要的机制,当微生物群体密度达到一定高时,通过释放特定的化学信号(自诱导物)来调控基因的转录表达,从而表现出一些群
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群体感应是微生物调节调控群体生理代谢活动的一种极为重要的机制,当微生物群体密度达到一定高时,通过释放特定的化学信号(自诱导物)来调控基因的转录表达,从而表现出一些群体行为活动,如生物发光、毒性因子的产生等。本课题期望通过转座子随机插入突变技术来研究Pseudoalteromonas sp.Rf-1群体感应的分子调控机制。首先,我们通过平行划线法确定了Pseudoalteromonas sp.Rf-1能产生群体感应信号分子酰基高丝氨酸内酯(AHL),建立了划线法和平板打孔法定性及定量表征AHL浓度的方法,该方法具有灵敏度高、操作简单等优点。随后,我们通过接合转移方法将E.coli S17-1(λπ)(pLOF/Km)中转座子mini-Tn10引入Pseudoalteromonas sp.Rf-1中,构建了含2000多个突变子的突变体库;通过菌落形态、颜色等表型筛选,挑取了600株候选突变子;用平行划线法和平板打孔法检测突变株所产信号分子浓度,筛选到7株因转座子插入突变而引起AHL缺失的突变株(B1、B2、B4、B5、B7、B8、B9)。采用热不对称PCR技术,确定巢式PCR的最佳反应程序和体系,成功确定1株突变株(B7)中mini-Tn10插入位点突变基因的部分序列。相似性分析表明,B7中突变基因与P.rubra SCSIO 6842中编码饥饿蛋白B(stringent starvation protein B)的基因(sspB)高度相似,其相似性为85%。通过三亲接合实验,对群体感应信号分子AHL表达缺失的突变株B7的突变基因sspB进行基因互补,实验结果表明,互补菌B7/pBBR1MCS-5ssp产AHL的能力基本恢复,证明基因sspB在Pseudoalteromonas sp.Rf-1中对群体感应有正调控作用。
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