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种子在土壤中萌发后,下胚轴快速伸长,同时形成顶端弯钩和黄化的子叶,此过程称为暗形态建成。黄化子叶中未形成成熟的叶绿体,而是形成黄化质体,也未合成成熟的叶绿素,而是积累了适量的叶绿素合成前体-原叶绿素酸酯。植物幼苗在出土之前进行异养生长,所需要的养分来自于胚乳等营养贮藏器官。破土见光后,子叶中的原叶绿素酸酯迅速转化为叶绿素,使幼苗能够进行光合作用,实现自养生长。黄化幼苗子叶中积累的原叶绿素酸酯对光照极为敏感。当过量的原叶绿素酸酯见光不能全部被原叶绿素酸酯氧化还原酶催化生成叶绿素酸酯时,游离的原叶绿素酸酯会产生大量的活性氧,进而引起光氧化伤害,最终导致幼苗的光漂白甚至死亡。由此可见,植物幼苗破土而出的转绿过程,是陆生植物整个生命周期中非常脆弱但极为关键的阶段,决定了植物是否能顺利存活。植物已经进化出复杂且精细的分子机制来调节原叶绿素酸酯的生物合成以调控黄化幼苗的转绿过程。油菜素内酯(BRs)是植物体内的甾醇类激素,在种子萌发、暗形态建成、细胞伸长、逆境胁迫响应等多个生物学过程中起着重要的调控作用,但油菜素内酯在植物幼苗由暗形态建成到光形态建成转变过程中的作用尚不清楚。在本论文中我们围绕“甾醇类激素油菜素内酯是否参与调控植物黄化幼苗出土见光转绿过程”这一关键科学问题展开实验。我们首先分析了 BRs相关突变体黄化幼苗见光过程中的转绿表型。实验结果显示BRs增多和信号增强的植物材料转绿能力都比野生型Col-0强,而BRs缺失和信号减弱的突变体幼苗的转绿概率都低于Col-0。同时,体外施加BRs类似物BL能够提高Col-0的转绿概率,并且能够恢复BRs缺失突变体det2-1的转绿缺陷表型。更重要的是功能获得性突变体bzr1-1D能恢复det2-1和bri1-301的转绿能力。此外我们还检测了这些突变体黄化苗中原叶绿素酸酯的含量,结果显示不能正常转绿的突变体黄化苗体内积累了过量的原叶绿素酸酯。以上结果说明BRs和BZR1通过抑制暗中原叶绿素酸酯的过量积累进而促进植物黄化幼苗的见光转绿过程。已有研究报道光信号转导途径中的转录因子PIFs在植物黄化幼苗转绿过程中起关键作用。遗传实验表明BZR1调控原叶绿素酸酯合成和控制植物黄化幼苗见光转绿过程都依赖于PIFs。为进一步探究BZR1和PIFs促进拟南芥黄化苗转绿的分子机制,我们对BZR1和PIFs共同调控的下游基因进行了深入的分析,发现GRFs转录因子被BZR1和PIFs共同调控。进一步研究表明BRs通过BZR1促进GRFs家族中GRF7和GRF8的表达,而光信号通过PIFs抑制它们的表达。同时染色质免疫共沉淀分析显示BZR1和PIF4都能结合到GRF7和GRF8启动子上,说明BZR1和PIF4都能直接诱导GRF7和GRF8的表达。在植物体内,microRNA396在转录后水平抑制GRFs的表达。为研究GRFs在植物黄化苗见光转绿过程中的功能,我们分析了 GRFs相关突变体以及过表达植株的黄化苗转绿表型,结果显示35Spro:miR396a、三突变体grf3 grf4 grf7(grf-t)和四突变体grf1 grf4 grf7 grf8(grf-q)的转绿能力都显著降低,而35Spro:MIM396和35pro:rGRF7过表达植株的转绿比率都高于Col-0。与转绿表型相一致,grf-t、grf和35pro:miR39aa黄化苗中原叶绿素酸酯含量都显著高于Col-0。以上结果证明miR396和GRFs在拟南芥黄化幼苗见光后转绿的过程中都起着十分关键的作用。为进一步解释35Spro:miR396a黄化幼苗见光不转绿的表型,我们对暗中生长4天的Col-0和35Spro:miR396a提取总RNA并进行RNA-Seq分析。GO分析发现在miR396a调控的基因中控制叶绿体发育和光合作用的基因显著富集。这些转录组数据为miR396和GRFs在植物光形态发生中发挥关键调控作用提供了有力证据。遗传实验表明,在细胞伸长和黄化幼苗转绿过程中,GRFs依赖于BZR1和PIFs,而BZR1和PIFs部分依赖于GRFs。同时,烟草叶片内参比双分子荧光互补实验、体外的蛋白-蛋白pull-down实验和体内的免疫共沉淀实验结果都显示GFR7与BZR1和PIF4存在相互作用。为进一步证明GRFs、BZR1和PIF4相互作用在调控黄化幼苗见光转绿过程中的重要性,我们系统分析了 GRFs、BZR1和PIF4相关突变体及遗传杂交材料黄化苗中的原叶绿素酸酯合成相关基因的表达水平。结果显示,det2-1和pifq中HEMA1、HEMB1、CHLH、GUN4和CHLD表达量显著升高,而bzr1-1D能降低det2-1中这些基因的表达量,但对pifq没有影响。35Spro:MIM396能够抑制det2-1中部分基因的高表达,但对pifq也没有影响。这些结果表明BZR1、GRFs和PIFs在暗中都能抑制叶绿素合成相关基因的表达以降低原叶绿素酸酯的含量,但PIFs占据主导地位。本项研究揭示了油菜素内酯(BRs)在拟南芥黄化苗从暗形态建成到光形态建成的转变过程中发挥的重要功能,并阐明油菜素内酯能通过抑制幼苗在暗中原叶绿素酸酯和活性氧的合成,促进植物黄化幼苗见光转绿的分子机制,为下一步利用油菜素内酯提高作物幼苗的存活率奠定了扎实的理论基础。其次本论文找到一个新的调控植物黄化幼苗转绿的关键因子miR396,过表达miR396或减弱其靶基因GRFs的功能都会导致植物幼苗不能正常转绿,并导致体内积累大量的原叶绿素酸酯和活性氧,而降低miR396活性能够促进植物黄化幼苗转绿,这不仅扩展了我们对植物黄化幼苗见光转绿的认识,也增进了对microRNA在植物发育中功能的认识。另外,本文还证明GRFs介导了 BRs和光信号的相互作用,是BRs和光信号调控植物生长发育的一个新的交叉点,加深了我们对BRs和光信号相互交叉调控植物生长发育的理解和认识。