论文部分内容阅读
首例体细胞核移植克隆猪虽已诞生多年,但核移植效率仍然很低。体细胞核移植多采用体外成熟的MⅡ期卵母细胞去核后作为受体卵。但由于猪卵母细胞体外成熟体系还不够完善,所以仍需进一步优化。同时,重构胚胎的不完全重编程会导致附植前胚胎不能正常发育。即使极少数胚胎能够发育存活并诞下后代,后代也常伴有不同程度的发育缺陷或表型异常。相比着床前的胚胎和克隆动物胎儿,目前对表型异常的克隆猪的甲基化模式研究仍然较少,其分子生物学机制仍不清楚。本文拟通过在卵母细胞成熟液中添加红景天多糖(rhodiola sachalinensis polysaccaride,RSP)来获得高质量的体外成熟卵母细胞,同时尝试应用新型甲基化转移酶抑制剂RG108来纠正附植前胚胎的异常甲基化修饰状态,以提高核移植效率。本实验室在随后的克隆猪的生产中一共诞下了4头克隆猪,其中一头出生后不久死亡,另有2头克隆猪发生隐睾。针对这两头隐睾克隆猪,我们研究了其睾丸发育相关基因表达及其甲基化的变化。主要研究结果如下：(1)在猪卵母细胞成熟液中添加0.6、6和60mg·L-1的RSP,以第一极体作为核成熟的标志,计算卵母细胞核成熟率；统计体外受精(IVF)和体细胞核移植(SCNT)后胚胎的卵裂率和囊胚率,并检测成熟卵母细胞内谷胱甘肽(GSH)的浓度及活性氧(ROS)水平。结果表明：成熟液中添加6和60mg·L-1RSP均能显著提高成熟后卵母细胞内GSH含量,且添加60mg·L-1RSP组成熟的卵母细胞用于IVF和SCNT后卵裂率和囊胚率都显著增高。(2)使用RG108处理猪胎儿成纤维细胞(Porcine fetal fibroblast,PFF),研究其对细胞甲基化水平和核移植效率的影响。使用0.05,0.5,5和50μmol·L-1RG108分别处理细胞24,48和72h后,用高效液相色谱和亚硫酸氢盐测序(Bisulfite sequencing PCR,BSP)法分析细胞整体甲基化水平和印迹基因H19和IGF2R的DMR区甲基化率,并检测RG108处理对细胞生长、凋亡、染色体变化。结果表明：RG108降低细胞整体甲基化水平呈时间依赖性,50μmol·L-1RG108处理PFF细胞72h后整体甲基化水平显著低于对照组；5和50μmol·L-1处理PFF72h后H19的DMR区域甲基化率显著降低；PFF经RG1080.5,5和50μmol·L-1处理72h后凋亡比例显著提高,但处理组对细胞生长和细胞染色体数目没有显著影响。(3)选用四种浓度的RG108处理时间为72h,研究单独处理供体细胞、单独处理融合后重构胚以及同时处理供体细胞和融合后重构胚三种不同处理方式对核移植效率的影响。结果发现,50μmol·L-1RG108处理供体细胞后的重构胚囊胚率显著提高。随后通过免疫荧光法比较IVF囊胚、SCNT囊胚和50μmol·L-1RG108处理供体细胞后获得的SCNT囊胚的甲基化水平发现,RG108处理组的囊胚的甲基化水平与IVF囊胚更接近。(4)为查明本课题组所获得的2头体细胞克隆小型猪猪隐睾发生的可能原因,本研究采用相对荧光定量PCR技术和亚硫酸氢盐测序法分析SOX9和INSL3基因在克隆猪隐睾中的表达量及其启动子区CpG位点甲基化状态。结果表明：除了SOX9基因在克隆猪C2中的表达量显著高于对照组N外,克隆猪SOX9和lNSL3基因的表达量都显著低于对照组N；亚硫酸氢盐测序结果显示SOX9基因启动子区在克隆猪C1和C2中的甲基化程度没有显著变化,而INSL3基因启动子区在克隆猪C1和C2中的甲基化程度均显著高于对照猪N。综上所述：成熟液中添加RSP能够提高IVM卵母细胞质量,60mg·L-1RSP组成熟的卵母细胞用于IVF和SCNT后能显著提高胚胎发育能力；RG108处理PFF72h后细胞整体甲基化水平降低且呈时间依赖性,同时H19的DMR区域甲基化率也显著降低；50μmol·L-1108处理PFF72h组还能显著提高核移植效率,其囊胚整体甲基化水平较对照组SCNT囊胚低,与IVF囊胚的水平更接近；INSL3基因在克隆猪隐睾中的DNA甲基化模式异常,影响其正常表达,这可能是导致克隆猪发生隐睾的重要因素之一。