论文部分内容阅读
肌萎缩性侧索硬化(ALS)是常见的神经退行性疾病,在脑干,皮层和脊髓中的运动神经元逐渐退化,从而引起肌肉瘫痪。大多数患者在疾病发病后三至五年内死于呼吸衰竭。大部分ALS病例是散发性的(s ALS),而10%是家族性的(f ALS)。20%的f ALS由突变体超氧化物歧化酶1(SOD1)基因引起。最新研究描述了其他重要的ALS诱导突变,包括反应性反应DNA结合蛋白43(TDP-43)和染色体9开放阅读框架72(C9ORF72)。我们对这种疾病的确切原因和病理生理学知之甚少。而这一疾病没有有效的治疗方法,因此理解这种疾病的发病机制有助于探索新的治疗手段。越来越多的证据表明线粒体功能障碍在神经退行性疾病,包括亨廷顿舞蹈病,帕金森病,阿尔茨海默病和肌萎缩性侧索硬化症的发病机制中发挥重要作用。线粒体在氧化应激,线粒体自噬,谷氨酸兴奋性毒性和内源性凋亡途径中起关键作用。在ALS的转基因小鼠模型中,在运动功能障碍之前就存在线粒体的肿胀和空泡化。线粒体异常在疾病进展过程中逐渐发展。线粒体是决定细胞死亡和存活的主要细胞内细胞器。内源性凋亡途径在这个细胞器中启动,老化的和功能失调的线粒体通过线粒体自噬被清除。最近,基因治疗成为一种有效的治疗手段,通过自我互补(sc)腺相关病毒(AAV)载体介导的人胰岛素样生长因子-1(hIGF-1)的研究已经显示其对ALS小鼠模型的积极治疗作用。在本研究中,我们应用嗜神经的腺相关病毒血清9型(AAV9)携带编码双链的人IGF-1基因(scAAV9-hIGF-1)作用于TDP-25稳转细胞系及经肌肉注射的途径干预G93A-SOD1转基因小鼠,观察到在体内和体外实验中,通过上调抗凋亡蛋白(Bcl-xl,Bcl2)的表达和下调促凋亡蛋白(Bax,Bak,Cytochrome C)内源性凋亡途径被激活,线粒体自噬也在scAAV9-hIGF-1处理后被激活。我们证明了线粒体电跨膜电位增加和异常线粒体的转化。此外,为了证实这些发现,使用CRISPR-Cas9系统在SOD1G93A小鼠模型中敲除IGF-1。我们发现IGF-1对线粒体的保护作用在基因敲降后下降。这些新的发现表明IGF-1在ALS小鼠和细胞模型中强烈保护了线粒体,以保护线粒体功能为靶向的治疗可能有希望治疗ALS。我们经查阅国内外文献发现类似报道极少。第一部分scAAV9-hIGF-1对ALS细胞模型线粒体的作用及其机制目的:我们对ALS细胞模型TDP-25稳转细胞系干预scAAV9-hIGF-1及AAV9-GFP,观察线粒体膜电位、线粒体形态及线粒体相关凋亡通路及自噬通路蛋白含量变化,探索基因转导hIGF-1对ALS细胞模型线粒体的保护作用及其作用机制。方法:我们选取TDP-25稳转细胞系作为细胞模型,在细胞培养液中给予不同浓度scAAV9-hIGF-1干预,利用细胞活力检测试剂盒CCK8测定不同浓度的细胞活力;利用酶联免疫吸附试验ELISA检测细胞及培养液中hIGF-1的含量;进一步采用蛋白免疫印迹方法测定scAAV9-hIGF-1及AAV9-GFP作用不同时间点的GFP及VDAC的表达,从而选取作用的最佳浓度及时间。采用该浓度及时间进行下一步试验。试验组细胞培养液中给予scAAV9-hIGF-1,对照组细胞培养液中给予AAV9-GFP,应用透射电镜观察细胞中线粒体的形态学变化;采用流式细胞学分析线粒体膜电位变化;新鲜取材提取细胞线粒体及胞浆蛋白,经过蛋白免疫印迹方法分析Bcl2、Bcl-xl、Bax、Bak、Cytochrome C、LC3、P62的蛋白含量变化。结果:1在TDP-25稳转细胞系细胞培养液中给予不同浓度scAAV9-hIGF-1干预,应用CCK8测定在1×107vg/ul浓度时细胞活力最好,与对照组差别具有统计学意义(P﹤0.05)。利用酶联免疫吸附试验ELISA检测细胞及培养液中hIGF-1的含量均明显高于对照组,差别具有统计学意义(P﹤0.05)。GFP的表达具有时间依赖性,随时间增加而增长,而VDAC的表达在60小时达到高峰,随后下降。细胞在显微镜下观察荧光结果与蛋白印迹结果相同,从而选取1×107vg/ul浓度作用60小时。2透射电镜观察GFP组细胞中线粒体嵴消失、断裂、空泡化、胞浆水肿、核染色质疏松,而IGF-1组线粒体形态为长椭圆形,未见嵴消失、空泡化等现象。3对细胞进行流式细胞学分析线粒体膜电位变化,GFP组线粒体膜电位低于IGF-1组,差别具有统计学意义(P﹤0.05)。4提取细胞线粒体及胞浆蛋白,经过蛋白免疫印迹方法,显示在IGF-1组的线粒体组分中,Bcl2、Bcl-xl、LC3-Ⅱ的蛋白含量升高,Bax、Bak、P62的蛋白含量下降,Cytochrome C在线粒体组分中升高,细胞组分中下降,提示在IGF-1组Cytochrome C主要存在于线粒体中,而在GFP组,Cytochrome C在线粒体组分中下降,细胞组分中升高,提示Cytochrome C释放到胞浆中,差别具有统计学意义(P﹤0.05)。结论:IGF-1可以保护ALS细胞模型中的线粒体,IGF-1通过提高线粒体膜电位,改善线粒体形态,抑制内源性凋亡通路中的促凋亡蛋白,升高抗凋亡蛋白的表达,促进线粒体自噬,从而起到保护线粒体的作用。第二部分ALS小鼠模型肌肉注射scAAV9-hIGF-1对线粒体的作用及其机制目的:我们采用嗜神经性的腺相关病毒血清型9(AAV9)携带的编码双链的人胰岛素生长因子1-IGF-1基因(scAAV9-hIGF-1)经肌肉注射途径干预60天龄G93A-SOD1转基因雌性小鼠,观察干预后其线粒体形态学变化、线粒体膜电位改变及线粒体相关凋亡通路及自噬通路蛋白含量变化,探索基因转导hIGF-1对ALS小鼠线粒体的保护作用及其作用机制。方法:我们采取美国Jackson实验室购买的肌萎缩侧索硬化的转基因小鼠G93A-SOD1及野生型WT-SOD1为动物模型,应用PCR技术对SOD1基因进行DNA鉴定,鉴定结果为阳性的同窝转基因G93A-SODl雌性小鼠及同年龄的野生型WT小鼠经随机配对作为研究对象。在G93A-SODl及WT-SOD1小鼠60天龄时,同窝阳性G93A-SOD1转基因雌性小鼠采用随机的方法分配到治疗组肌肉注射scAAV9-hIGF-1,对照组肌肉注射AAV9-GFP,及阴性对照同年龄WT-SOD1各13对。在肌肉注射后约40-50天时,其中3对利用4%多聚甲醛溶液经心脏灌注固定,通过免疫组化染色观察IGF-1在腰髓神经元中的表达,免疫荧光染色观测腰髓组织GFP的表达特点;1对经2.5%戊二醛溶液固定后用透射电镜观察腰髓前角运动神经元中线粒体的形态学变化;3对用新鲜取材的方法提取小鼠脊髓细胞进行流式细胞学分析线粒体膜电位变化;6对快速新鲜取材提取腰髓线粒体及胞浆蛋白,经过蛋白免疫印迹方法分析Bcl2、Bcl-xl、Bax、Bak、Cytochrome C、LC3、P62的蛋白含量变化。结果:1所有实验组的小鼠经PCR方法进行DNA鉴定后,确定为SOD1基因阳性G93A-SOD1及野生型WT-SOD1的雌鼠。2 60天龄G93A-SOD1转基因小鼠肌肉内注射scAAV9-hIGF-1及AAV9-GFP,约40天后4%多聚甲醛溶液经心脏灌注固定,免疫荧光染色观测腰髓组织GFP的表达主要在神经元,免疫组化染色观察IGF-1在腰髓神经元中也存在表达。3肌肉内注射scAAV9-hIGF-1及AAV9-GFP的G93A-SOD1小鼠及对照野生型WT-SOD1小鼠在100-110天龄时经过2.5%戊二醛溶液固定,透射电镜观察线粒体形态变化,GFP组线粒体存在嵴消失、空泡化、胞浆水肿、核染色质疏松,而IGF-1组线粒体形态与WT组相似,为长椭圆形,未见嵴消失、空泡化等现象。4肌肉内注射scAAV9-hIGF-1及AAV9-GFP的G93A-SOD1小鼠及对照野生型WT-SOD1小鼠在100-110天龄时提取小鼠脊髓细胞进行流式细胞学分析线粒体膜电位变化,GFP组线粒体膜电位低于IGF-1组及WT组,差别具有统计学意义(P﹤0.05)。5肌肉内注射scAAV9-hIGF-1及AAV9-GFP的G93A-SOD1小鼠及对照野生型WT-SOD1小鼠在100-110天龄时快速新鲜取材提取腰髓线粒体及胞浆蛋白,经过蛋白免疫印迹方法,显示在IGF-1组及WT组的线粒体组分中,Bcl2、Bcl-xl、LC3-Ⅱ的蛋白含量升高,Bax、Bak、P62的蛋白含量下降,Cytochrome C在线粒体组分中升高,细胞组分中下降,提示在IGF-1组及WT组Cytochrome C主要存在于线粒体中,而在GFP组,Cytochrome C在线粒体组分中下降,细胞组分中升高,提示Cytochrome C释放到胞浆中,差别具有统计学意义(P﹤0.05)。结论:IGF-1可以保护ALS动物模型中的线粒体,IGF-1通过提高线粒体膜电位,改善线粒体形态,抑制内源性凋亡通路中的促凋亡蛋白,升高抗凋亡蛋白的表达,促进线粒体自噬,从而起到保护线粒体的作用。第三部分ALS小鼠鞘内注射scAAV9-sg RNA-IGF-1-Cas9对线粒体的作用及其机制目的:我们利用CRISPR-Cas9系统,通过给予G93A-SOD1转基因雌性小鼠鞘内注射scAAV9-sg RNA-IGF-1-Cas9,探索敲降G93A-SOD1转基因雌性小鼠IGF-1的m RNA对其线粒体形态学变化、线粒体膜电位改变及线粒体相关凋亡通路及自噬通路蛋白含量变化,探索基因转导hIGF-1对ALS小鼠线粒体的保护作用及其作用机制。方法:我们采取美国Jackson实验室购买的肌萎缩侧索硬化的转基因小鼠G93A-SOD1为动物模型,应用PCR技术对SOD1基因进行DNA鉴定,鉴定结果为阳性的同窝转基因G93A-SODl雌性小鼠随机配对作为研究对象。在G93A-SODl小鼠30天龄时,同窝阳性G93A-SOD1转基因雌性小鼠采用随机的方法分配到实验组鞘内注射scAAV9-sg RNA-IGF-1-Cas9,对照组鞘内注射scAAV9-sg RNA-Lac Z-Cas9各10对。在鞘内注射后约50-60天时,其中1对经2.5%戊二醛溶液固定后用透射电镜观察腰髓前角运动神经元中线粒体的形态学变化;3对用新鲜取材的方法提取小鼠脊髓细胞进行流式细胞学分析线粒体膜电位变化;6对快速新鲜取材提取腰髓线粒体及胞浆蛋白,经过蛋白免疫印迹方法分析IGF-1、Bcl2、Bcl-xl、Bax、Bak、Cytochrome C、LC3、P62、optineurin的蛋白含量变化。结果:1在G93A-SOD1转基因小鼠中敲降IGF-1,实验组线粒体存在嵴消失、空泡化、胞浆水肿、核染色质疏松,而对照组线粒体形态为长椭圆形,未见嵴消失、空泡化等现象。2提取小鼠脊髓细胞进行流式细胞学分析线粒体膜电位变化,实验组线粒体膜电位显著低于对照组,差别具有统计学意义(P﹤0.05)。3实验组及对照组小鼠在80-90天龄症状具有差异时快速新鲜取材提取腰髓线粒体及胞浆蛋白,经过蛋白免疫印迹方法,显示在实验组的线粒体组分中,IGF-1、Bcl2、Bcl-xl、LC3-Ⅱ、optineurin的蛋白含量下降,Bax的蛋白含量升高,P62的蛋白含量无明显变化,Cytochrome C在线粒体组分中下降,细胞组分中升高,提示在实验组Cytochrome C释放到胞浆中,而在对照组,Cytochrome C在线粒体组分中升高,细胞组分中下降,提示Cytochrome C主要存在于线粒体中,差别具有统计学意义(P﹤0.05)。结论:在ALS小鼠脊髓中敲降IGF-1使线粒体功能障碍进一步加剧,线粒体膜电位下降,线粒体空泡化,形态异常,促凋亡蛋白表达升高,抗凋亡蛋白表达下降,抑制线粒体自噬通路,线粒体损伤恶化,疾病进一步加重。根据以上研究结果我们推论在ALS的发病过程中,线粒体功能障碍占有一定因素,线粒体是细胞的能量工厂,一旦线粒体功能障碍,细胞不能进行正常代谢,启动凋亡级联反应,不能通过自噬清除异常线粒体,疾病会恶化加剧。而IGF-1可以对这一过程产生保护作用,但其在线粒体自噬通路中的作用亟待进一步研究。通过基因载体表达hIGF-1对ALS小鼠及细胞模型保护了异常的线粒体,为临床ALS疾病的治疗提供了实验依据,保护线粒体功能为靶向的治疗可能有希望治疗ALS。