结瘤固氮是豆科植物与根瘤菌专一性作用的结果。在根瘤菌的第一步入侵至根瘤形成的每一个过程中，都伴随着宿主植物及根瘤菌特异性基因的表达。前人的研究已经证明，植物凝集素在豆科植物识别根瘤菌的过程中起着不可缺少的重要作用，通过豆科植物间凝集素基因的转化，可使一些豆科植物识别原本不能识别的根瘤菌。但是，人们在利用人上启动子将豆科植物凝集素基因转化到非豆科植物时，并未能使非豆科转基因植株识别相应的根瘤菌。鉴于此，有必要在非豆科植物上模拟豆科植物凝集素的原始表达机制，研究非豆科植物与根瘤菌的相互作用。 结瘤素基因(Nodulin Gene)是指特异地存在于根瘤菌感染产生的根瘤细胞中并参与共生固氮作用的植物基因，它们对于根瘤结构的形成及维持、固氮活性的保护以及固氮产物的代谢等都有重要作用。根据表达时间的先后，它可分为早期结瘤素基因和晚期结瘤素基因。早期结瘤素基因在根瘤发育早期表达，参与“根瘤菌——根毛”相互作用及根瘤形态发生过程，对植物与根瘤菌之间的信息传递、根瘤菌的侵染及根瘤的形成有着重要作用。目前已经发现了多个关键的早期结瘤素基因，并在一定程度上阐述了它们的功能，不过它们的工作机理仍有待进一步阐明。这些关键早期结瘤素基因在转化到非豆科植物中后，是否能发挥相应的功能，也需要进一步的探索。 本实验通过PCR技术从豌豆基因组DNA中克隆出豌豆凝集素基因(psl)及早期结瘤素基因PsENOD12A、PsSYM10、PsENOD40，构建了psl基因的植物表达载体pVCT-PsL，并利用农杆菌介导法将psl基因导入烟草。主要实验结果如下： 1.psl基因的克隆、表达载体构建及转化烟草 以豌豆(Pisum sativum L.)基因组DNA为模板，通过设计特异引物，利用PCR技术扩增获得psl基因。序列分析表明，该基因全长1948 bp，包括编码275个氨基酸的828 bp的开放阅读框、854bp的5’端控制区和266bp的3’端非翻译区。与已报道的序列(GenBank登录号X66368)相比较，核苷酸序列及推导的氨基酸序列同源性分别为99.4％和100％。将psl基因插入到pVCT2020，构建了该基因的植物表达载体pVCT-PsL。利用农杆菌介导法将psl基因导入烟草(Nicotiana tobacum L.cv．Wisconsin38)中，共获得10个独立的卡那霉素抗性烟草株系，移栽后全部成活并开花结果。PCR检测初步确定psl基因已转入烟草基因组中。 2.豌豆PsENOD12A基因的克隆 以豌豆基因组DNA为模板，通过设计一对特异引物，利用PCR技术扩增获得PsENOD12.4基因。序列分析表明，该基因全长1282 bp，含有编码110个氨基酸的333 bp的开放阅读框和936 bp的5’端控制区。与GenBank公布的已知序列(X81366)相比，其核苷酸序列及推测的氨基酸序列的同源率分别为99.9％(仅有1个碱基不同)和100％。 3.豌豆PsSYM10基因的克隆 以豌豆基因组DNA为模板，通过设计特异引物，利用PCR技术扩增获得PsSYM10基因。序列分析表明，该基冈全长3310 bp，包括编码594个氨基酸的1785 bp的开放阅读框、1000 bp的5’端控制区和525 bp的3’端非翻译区。与GenBank公布的已知序列(AJ575250)相比，其核营酸序列及推测的氨基酸序列的同源率分别为98.8％和100％。 4.豌豆PsENOD40基因的克隆 以豌豆基因组DNA为模板，通过设计特异引物，利用PCR技术扩增获得PsENOD40基因。序列分析表明，该基因全长459bp，包括编码75个氨基酸的228bp的开放阅读框、117bp的5’端控制区和114 bp的3’端非翻译区，其翻译启始密码子不是常见的ATG，而是稀有翻译启始密码子TTA。与GenBank公布的已知序列(X81064)完全一致。