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研究目的:肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是我国最常见的消化系统恶性肿瘤之一,肝癌恶性程度高,增殖与转移能力强,患者预后普遍很差。肿瘤缺氧微环境是肿瘤发生发展的重要驱动力,但其中涉及的分子机制尚未明确。Nrf2是一种核转录蛋白,主要调控机体氧化还原稳态,研究发现Nrf2在多种恶性肿瘤中高表达,Nrf2能够促进肿瘤细胞增殖及转移等多种生物学行为,但Nrf2在肝癌侵袭转移中的机制研究尚不明确。血管生成拟态(vascul ogenic mimi cry,VM)形成对肝癌转移侵袭有促进作用,VM是一种由肿瘤细胞不依赖内皮细胞围成的血管样结构。本研究通过探讨缺氧条件下Nrf2在肝癌细胞VM形成中的作用,深入研究肝癌转移发生的分子机制,这对肝癌的诊断、治疗以及预后都有重大价值。研究方法:1.选择肝癌细胞系HCC-LM3及Bel-7402,加入缺氧诱导试剂CoCl2建立细胞缺氧模型,通过划痕实验、侵袭实验、三维培养观察缺氧环境下肝癌细胞迁移侵袭能力、成管能力的变化。通过Western blot实验及免疫荧光实验观察缺氧环境下肝癌细胞中Nrf2蛋白以及VM相关蛋白HIF-1α、MMP2、MMP9、VEGF的表达变化。2.选择四种肝癌细胞系HCC-LM3、Huh7、MHCC-97H、MHCC-97L,通过Western blot实验观察这四种肝癌细胞系中Nrf2蛋白的本底表达情况,并筛选出其中两种肝癌细胞系,使用慢病毒包装Nrf2质粒后转染至肝癌细胞中,嘌呤霉素药筛出稳定转染的Nrf2上调及下调肝癌细胞系并使用Western blot实验进行验证。3.通过划痕实验、侵袭实验观察稳定转染Nrf2质粒后的肝癌细胞在缺氧环境下迁移及侵袭能力变化情况,继续通过三维培养功能实验观察缺氧环境下,Nrf2对肝癌细胞管道形成能力的影响。通过Western blot实验检测在缺氧条件下,转染Nrf2上下调质粒后肝癌细胞VM相关因子MMP2、MMP9、VEGF、HIF-1α、Twist-1、VE-cadherin 的表达变化。4.选择稳定转染Nrf2下调质粒以及下调对照质粒的Huh7肝癌细胞系,在缺氧条件下加入SUMO化抑制剂2-D08,通过划痕实验、侵袭实验、三维培养实验观察缺氧条件下抑制剂2-D08对肝癌细胞迁移侵袭能力以及管道形成能力的影响,通过Western blot实验观察缺氧条件下SUMO化抑制剂2-D08对肝癌细胞Nrf2表达水平的影响。研究结果:1.将肝癌细胞系HCC-LM3及Bel-7402在缺氧环境中处理后,迁移及侵袭实验结果显示缺氧环境下较常氧相比,肝癌细胞的迁移侵袭能力增强(P<0.05),三维培养功能实验结果显示缺氧条件下肝癌细胞的成管能力相对增强(P<0.05)。使用缺氧诱导试剂CoCl2处理肝癌细胞后,Western blot与免疫荧光实验结果均表明缺氧条件下肝癌细胞中Nrf2表达量较常氧增加(P<0.005),Western blot结果显示肝癌细胞中VM相关蛋白HIF-1α、MMP2、MMP9、VEGF在缺氧环境下表达增加(P<0.05)。2.通过Western blot实验观察四种肝癌细胞系(HCC-LM3、Huh7、MHCC-97H、MHCC-97L)Nrf2的表达情况,筛选出Nrf2本底高表达的Huh7肝癌细胞及Nrf2本底低表达的HCC-LM3肝癌细胞,将Nrf2过表达质粒转染至HCC-LM3肝癌细胞中,转染Nrf2降表达质粒至Huh7肝癌细胞中,加入嘌呤霉素药筛出稳定转染Nrf2的肝癌细胞,Western blot实验结果显示转染过表达质粒的HCC-LM3肝癌细胞中Nrf2表达量较对照组增加(P<0.05),而转染降表达质粒的Huh7肝癌细胞中Nrf2表达量较对照减少(P<0.05)。3.使用稳定转染后的上下调肝癌细胞系(HCC-LM3、Huh7),划痕实验、侵袭实验以及三维培养实验结果显示:在缺氧环境中,上调Nrf2表达后的HCC-LM3肝癌细胞迁移能力、侵袭能力及成管能力较对照组增强(P<0.05),而Huh7肝癌细胞系下调Nrf2表达后,其迁移能力、侵袭能力及成管能力相比对照组减弱(P<0.05)。Western blot实验结果显示:缺氧条件下,转染Nrf2过表达质粒的HCC-LM3肝癌细胞中,VM相关因子MMP2、MMP9以及VEGF表达量相较对照组增加(P<0.05),与此相反,转染Nrf2降表达质粒后的Huh7肝癌细胞中,MMP2、MMP9以及VEGF表达量相比对照组减少(P<0.05)。4.加入SUMO化抑制剂2-D08后,划痕实验结果显示:SUMO化抑制剂2-D08降低肝癌细胞的迁移速度(P<0.05),并且迁移速度与2-D08浓度呈负相关,敲除肝癌细胞Nrf2表达后加入抑制剂2-D08,相同时间点肝癌细胞的迁移速度无明显变化(P>0.05),侵袭实验以及三维培养实验结果显示SUMO化抑制剂2-D08抑制肝癌细胞侵袭能力以及管道形成能力(P<0.05),而肝癌细胞Nrf2降表达后加入2-D08发现肝癌细胞穿透滤膜数量以及成管数量无明显改变(P>0.05),Western blot结果发现SUMO化抑制剂2-D08不影响肝癌细胞Nrf2蛋白表达水平(P>0.05)。研究结论:1.缺氧促使肝癌细胞的迁移侵袭性增加,并且能够促进肝癌细胞的管道形成能力。2.缺氧环境下肝癌细胞VM相关蛋白HIF-1α、MMP2、MMP9以及VEGF表达增加。3.缺氧条件下Nrf2能够促进肝癌细胞迁移侵袭及成管能力。4.缺氧条件下Nrf2促进肝癌细胞VM关键蛋白MMP2、MMP9以及VEGF的表达。5.抑制Nrf2的SUMO化修饰降低肝癌细胞迁移侵袭以及成管能力。6.SUMO化抑制剂2-D08不影响肝癌细胞Nrf2的蛋白稳定性。