目的：肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一种进行性和致命性神经退行性疾病,累及运动皮层、脑干及脊髓前角运动神经元,逐渐出现进行性加重的衰弱和骨骼肌萎缩，最终导致瘫痪和死亡[1]。临床特征是上、下运动神经元受损的症状并存，而感觉和括约肌功能一般不受影响，其发病机制尚不明确。约5-10%为家族性ALS（familialALS，fALS），90-95%是散发性ALS（sporadic ALS, sALS）。大约20%家族性ALS病例及4%散发性ALS病例与铜锌超氧化物歧化酶（Cu/Znsuperoxide dismutase1，SOD1）突变有关。ALS是一种多因子疾病，遗传和环境因素，如毒素和感染，通过协同作用影响疾病的发生和发展[2]。流行病学研究表明职业，如接触重金属或化工、机械或电气创伤和剧烈的体育活动等可能影响ALS的发病率。年龄和性别是与本病重要的相关危险因素[3,4]，可影响疾病的发生发展及临床表现。事实上，ALS多为中年发病，发病年龄高峰为45-70岁，男女发病率未2.6：1[5]，导致这一差异的原因尚不清楚，暗示性激素可能参与该病的发生。在过去的10多年里，一些研究证实性激素对发育期和成人正常神经活动具有显著的营养作用[6,7]，尤其是雄激素（睾酮和双氢睾酮）可影响体内脊髓和脑干运动神经元的形态和存活[8,9]，脱氢表睾酮和硫酸脱氢表雄酮（DHEAS）为主要的循环类固醇,可以抑制谷氨酸介导的神经毒性[10]作用。此外，研究证明雌激素通过也可基因组和非基因效应发挥明显的神经保护作用[11]。本研究在此基础上，在无菌条件下对50天雄鼠进行去势手术，应用免疫组化方法研究了SOD1-G93A转基因小鼠腰髓的形态学变化情况，应用免疫印迹法研究突变SOD1蛋白、自噬标示物LC3Ⅱ和P62、氧化应激标示物HO-1和GCLM及凋亡指标CASPASE3随病程进展表达变化，探讨雄激素对雄性SOD1-G93A转基因小鼠病情变化及发展的影响，研究导致ALS发病具有明显性别差异的可能机制，为以后ALS的诊断和个体化治疗提供实验依据。方法：1转基因鼠的繁殖动物实验过程严格遵守河北省实验动物管理办法规定，所有SOD1-G93A转基因鼠均饲养在恒温（25-27℃）、恒湿、无特定病原菌（specific pathogen free，SPF）环境中，喂以灭菌的SPF级颗粒型鼠类饲料和无菌水。为维持B6SJL-TgN（SOD1-G93A）1Gur转基因小鼠突变基因稳定下传，用B6SJL SOD1-G93A/+半合子雄鼠与B6SJLF1/J雌鼠交配繁殖，两种小鼠均购自美国Jackson实验室（Bar Harbor, ME, USA）。于3-4周时剪取子代鼠尾部组织进行基因鉴定，以明确否携带有hSOD1基因。2实验分组取7周左右雄鼠，根据鉴定结果，随机分为四组，后进行手术处理，分为阳性去势组、阳性假手术组、阴性去势组和阴性假手术组。依据SOD1-G93A小鼠的发病规律分为症状前期（60天）、症状早期（100-120天）和终末期（130-150天）,在这3个时间点取材。阳性组为SOD1-G93A转基因小鼠，阴性组为各时期非转基因同窝对照小鼠，四组均在每个时间点留取6只小鼠。症状前期取自出生后60天，体重无减轻且无临床症状，评分4分，症状早期指体重开始减轻、出现步态异常，评分2分。终末期指小鼠体重减轻20%以上，仰卧30秒不能翻身，评分0分。3实验方法3.1取材各组小鼠各个时期用10%的水合氯醛腹腔内注射麻醉后，分别以4%多聚甲醛灌流固定保存或新鲜取腰髓等所需组织迅速投入液氮速冻后于-80℃冰箱保存。3.2免疫组化法腰髓经4%多聚甲醛固定采用震荡切片；切成30μm切片；0.01M PBS洗5分钟×3次,0.3%过氧化氢浸泡15分钟以封闭组织内源性过氧化物酶；0.3%Triton打孔30分钟；10%马血清封闭约30分钟;一抗封闭过夜；洗去一抗，加二抗封闭2小时；洗去二抗，加辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素室温1小时；DAB染色3-10分钟；蒸馏水终止染色，铺片，晾干；脱水；透明；封片3.3免疫印迹（Western blotting）分别提取腰髓总蛋白，用BCA法测蛋白浓度。每个样品蛋白上样量为80μg，用10%或13%SDS-PAGE电泳后转膜至PVDF膜，5%脱脂奶粉（PBS稀释）室温封闭1小时后，分别加兔抗ACTIN抗体（1:600）兔抗P62抗体（1:1500）、兔抗GCLM（1:1000）、兔抗HO-1（1:1000）、羊抗SOD1抗体（1:500）、兔抗LC3Ⅱ（1:1500）及兔抗caspase3（1:1500）4℃摇床过夜。次日，TPBS洗膜4次，每次5分钟。然后分别加入抗兔和抗羊荧光二抗（1:10000）室温孵育1小时，TPBS洗膜3次，PBS洗膜1次，每次均为5分钟，Odyssey红外扫描成像系统（美国LI-COR公司）扫膜并分析结果。计算目的条带与ACTIN或GAPDH的灰度比值并进行统计学处理。3.4统计学分析实验结果以x±s差表示，采用SPSS13.0.4软件，统计方法为多样本参数方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。结果：1转基因鼠的鉴定子代鼠基因组DNA的PCR产物电泳显示：内参照IL-2的PCR产物为位于300-400bp之间的条带（324bp）；人SOD1基因的PCR产物为位于200-300bp之间的条带（236bp）。2临床表变化在60天及以前，SOD1-G93A小鼠无明显临床变化；80-90天左右，悬尾实验时可见小鼠开始出现双后肢震颤；在100-120天左右SOD1-G93A小鼠逐渐出现一侧或双侧后肢明显无力、步态异常及轻微的肌肉萎缩；随后，双后肢进行性肌肉萎缩，不能支撑身体，进而至少一侧后肢完全瘫痪，行走时拖拽；约在130-150天左右，将其仰卧后30秒内小鼠不能自行翻转，体重下降超过20%，达到终末期。阴性非转基因小鼠无上述临床表现。3腰髓形态学变化通过DAB染色观察到在转基因小鼠和非转基因小鼠中，各时期去势组小鼠胶质细胞增生均较假手术组明显。尤其是转基因小鼠，随着病情的进展，小胶质细胞及星形胶质细胞明显增生紊乱，而在非转基因小鼠中，随着年龄的增长，未见胶质细胞明显增生。4目的蛋白的表达通过免疫印记法观察在转基因小鼠中各时期去势组较假手术组腰髓突变SOD1蛋白表达量均增加（P<0.05）；在转基因和非转基因各组小鼠中各时期去势组较假手术组腰髓自噬标示物LC3Ⅱ的表达量均增加（P<0.05），转基因小鼠中更为明显。随着病程进展，P62蛋白的表达在转基因小鼠中较非转基因小鼠表达量明显增加，手术组较假手术组含量未见明显增多；在转基因和非转基因各组小鼠腰髓中HO-1和GCLM表达具有相同的变化趋势，各时期去势组较假手术组表达量均增加（P<0.05），在转基因小鼠中尤为明显；在转基因和非转基因各组小鼠中症状前期caspase3活化均不明显，随着病情进展，去势组caspase3活化片段表达量均较假手术组增加（P<0.05），转基因小鼠终末期尤为明显。结论：SOD1-G93A转基因小鼠及非转基因小鼠去势组较假手术组腰髓胶质细胞增生。SOD1-G93A转基因小鼠胶质细胞在症状前期增生不明显，随着病程进展不断增多，至疾病后期明显增生、紊乱，去势组胶质细胞增生较假手术组明显，说明雄激素具有抗胶质细胞增生作用。自噬标示物LC3Ⅱ、氧化应激标示物HO-1和GCLM及凋亡指标Caspase3在去势组腰髓中的表达较假手术组均增加，尤其在SOD1-G93A转基因小鼠明显，说明雄激素具有一定程度的调节自噬和氧化应激及抗凋亡作用。ALS发病具有明显的性别差异，男性明显多于女性，性激素可能为导致这一差异的最大原因，雄激素可能通过抗胶质细胞增生及神经炎症，调节自噬和氧化应激功能及抗凋亡作用等机制来影响疾病的发生及发展。