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随着石化能源枯竭、环境污染和资源匮乏等问题的日益突出，氢能作为一种环境友好的可替代能源受到了人们的普遍关注。暗发酵制氢具有产氢速度快、反应条件温和、设备简单，以及能够利用可再生有机废弃物等特点，具有广阔发展前景，成为目前生物制氢的重要研究方向。然而，野生菌的产氢效率低，发酵成本高等缺陷一直制约着暗发酵制氢的工业化。为此，研究产氢机理和调控产氢代谢相关途径成以提高厌氧暗发酵细菌产氢能力成为当前研究热点。克雷伯菌具有易于培养、底物适应性强、产氢效率高等优点，具有厌氧产氢潜力。本研究以克雷伯野生菌Klebsiella sp. HQ-3及本实验室已构建的敲除了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc的工程菌HQ-3-P为出发菌株，通过过表达甲酸氢裂解途径、NADH途径中的正向调控因子和辅酶因子，构建高效重组菌株，并对产氢效率最高的重组菌的发酵条件进行了优化。此外，还探讨了以油脂抽提藻渣的酶解液为碳源暗发酵产氢。为进一步开发基于克雷伯菌暗发酵产氢提供有益探索。主要研究内容和结果摘要如下：1.构建同源过表达代谢调控因子和辅酶因子的高效重组菌。以克雷伯菌Klebsiella sp. HQ-3基因组DNA为模板，扩增得到甲酸氢裂解酶系统的转录激活蛋白（FHLA）fhlA基因、全局转录调控因子(FNR)fnr基因、甲酸脱氢酶（FDH-H）fdhF基因，以及NADH途径中编码烟酸转磷酸核糖激酶(NAPRTase)的pncB基因。连接改造后的表达载体pET28a-Pkan，构建重组质粒pET28a-Pkan-fhlA、pET28a-Pkan-fnr、pET28a-Pkan-fdhF、pET28a-Pkan-pncB，分别电转至野生菌株HQ-3及工程菌HQ-3-P中，获得8种重组菌。利用气相色谱检测重组菌产氢特性。与野生菌HQ-3相比，HQ-3-fdhF、HQ-3-pncB、HQ-3-fnr、HQ-3-fhlA的产氢效率分别提高了7.28%、11.62%、12.26%、15.45%；HQ-3-P/fdhF、HQ-3-P/pncB、HQ-3-P/fnr、HQ-3-P/fhlA与出发菌株HQ-3-P相比，分别提高了12.33%、15.58%、19.13%、29.35%。2.重组菌HQ-3-P/fhlA发酵条件的优化。选择对产氢发酵影响较显著的接种量、温度和初始pH三种因素进行单因素优化，实验结果显示，菌体最佳接种量为20%、最适温度为33°C、最适初始pH为6.5。利用CCD-RSM对氢气产量进一步响应面优化，发酵产氢的最佳工艺条件为：接种量21.26%，温度31.75°C，初始pH6.67。在此条件下，实验验证产氢量为3.214mol H2/mol葡萄糖，与预测值3.236mol H2/mol葡萄糖非常接近，回归方程比较准确地预测了各因素的影响。3.油脂抽提藻渣（LMBRs）预处理发酵产氢的初步研究。藻渣纤维素“预处理-酶解法”采用超声、稀HCl、稀NaOH、氨水浸泡预处理，中和后，再以纤维素酶处理。经过不同预处理的还原糖得率以热碱结合纤维素酶法效果最佳，并在发酵制氢中氢累积量也最高，达到652mL/L。藻渣处理后的剩余残渣中还含有难降解蛋白质及微量矿物质，该残渣与酵母废弃物（LYBRs）可实现共降解。